W4304酸性氧化铝固相萃取柱和阳离子交换柱在兽药检测中的

1、农产品/食品质量安全检测技术课程-微教材微课编号W4304微课名称酸性氧化铝固相萃取柱和阳离子交换柱在兽药检测中的应用所属模块农产品/食品中农药残留检测子模块M4-3水产品中违禁抗菌药物的检测海虾中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定关键词净化；固相萃取柱；阳离子交换柱是否通用通用 农产品 食品是否重点建设是 否微课类型实验实训型微课形式混合拍摄式微课类型实验实训型教学目标掌握固相萃取柱和离子交换柱的原理及使用方法。教学内容知识点技能点1、固相萃取方法的建立与优化2、酸性氧化铝固相萃取柱特点3、阳离子交换柱特点1、孔雀石绿和结晶紫兽残净化的规范操作2、固相萃取仪的使用知识讲解一固相萃取方法的建立与优化

2、固相萃取，即Solid Phase Extraction，简称 SPE，是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术。主要用于样品的分离，净化，和富集。主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。SPE是利用选择性吸附于选择性洗脱的液相色谱分离法原理。较常用的方法是使液体样品溶液通过吸附剂，保留其中被测物质，在选择适当强度溶剂冲去杂志，然后用少量溶剂迅速洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出；或同时吸附杂质和被测物质，再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。在样品分离过程中如何选择固相萃取柱及如何分离是被检测物质是一个相对比较困难的问题，下面

3、主要介绍一下固相萃取方法的建立和优化：固相萃取技术使用起来虽然比液液萃取简单，但建立一个固相萃取的方法并无快捷方式可走。建立固相萃取方法必须考虑与萃取过程相关的多种因素，归纳起来可从三个方面考虑：即确定萃取的目的及要求、建立初步的固相萃取方法、方法的优化。1确定萃取的目的及要求建立初步的萃取方法要考虑：选择合适的SPE柱；选择合适的固相萃取方法；方法的优化a) 柱填料的选择首选根据目标化合物与干扰物的差异，如极性，分子量，pka值等，选择合适的填料。2.2 固相萃取柱规格的选择对于反相、正相和吸附型固相萃取柱来说，被萃取样品的质量不超SPE柱填料的5%；离子交换型的固相萃取柱，必须考虑离子交换

4、的容量。SAX和SCX其吸附容量为0.2mg/g，下表附SPE小柱的容量和洗脱参数SPE柱上样容量和洗脱体积的选择选择合适的固相萃取方法固相萃取的保留机制可分为两种：2.3.1 吸附剂（填料）保留目标化合物：绝大多数化合物应用此机制，填料保留其目标组分及少量杂质，通过淋洗步骤去除吸附在柱上的少量杂质，最后选择合适的（洗脱）溶剂把目标组分洗脱下来。根据吸附剂的保留机理可进一步分为：（1）反相（C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1） 分析物：非极性至中等极性 基质：水溶性 方法： 1.活化：通常用水溶性有机溶剂如甲醇活化，然后用水平衡 2.淋洗：含0-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗杂质 3.

5、洗脱：极性或非极性溶剂洗脱目标物（2）正相（Silica, Florisil,Diol,NH2） 分析物：中等极性到强极性 基质：非极性至中等极性 方法： 1.活化：非极性有机溶剂 2.洗脱：非极性有机溶剂（3）阳离子交换（SCX,PRS,COOH） 分析物：阳离子（碱性）化合物 方法： 1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂过柱后，然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。 2.上样：样品溶液pH值要小于其pKa两个单位（以保证其带电荷 ） 3.洗脱：洗脱溶液pH值要大于其pKa两个单位（中和分析物的电荷）（4）阴离

6、子交换（SAX,PSA,NH2，PAX/MAX ） 分析物：阴离子（酸性）化合物 方法： 1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂活化后，然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。 2.上样：样品溶液pH值要大于其pKa两个单位（以保证其带电荷 ）。 3.洗脱：洗脱溶液pH值要小于其pKa两个单位（中和分析物的电荷）。2.3.2 吸附剂（填料）保留杂质：食品中色素等杂质的去除多用此机制。填料保留杂质而不保留或只保留极少量的目标组分，所以上样后即开始收集目标组分，最后用目标物所在的溶剂进一步洗脱。合并两部分收集液。 1.活

7、化：以样品所在的有机溶剂进化活化，1-2柱管体积 2.上样：提取液转移至柱内，并收集流出液 3.洗脱：用样品所在的有机溶剂进一步洗脱，收集流出液。合并上样和洗脱流出液。3固相萃取方法的优化影响萃取效率的因素1）填料（固定相）- 核心选择合适的SPE柱是保证理想结果的前提2）洗脱溶剂的强度：Ø 采用正相固定相时，溶剂强度随其极性增强而增加；Ø 采用反相固定相时，溶剂强度随极性减弱而增强。3）pH值： 离子交换固定相、被分析物和干扰物质的pKa各不相同。通过调节pH大小，可以使固定相带电荷，被分析物带相反电荷，而使干扰物质不带电荷；或者反过来，使固定相带电荷，干扰物质带相反电荷

8、，而使被分析物不带电荷。4）其他.常见问题及解决方法1）分析物回收率低2）萃取重现性差3）洗脱馏分中含有干扰物4）SPE柱流速降低或阻塞具体解决方案如下：1）分析物回收率低 未保留？ 被淋洗？ 未被洗脱或部分洗脱？首先要把上样液、淋洗液、洗脱液均收集，进样分析，确定问题来源2）重现性差3）洗脱馏分中含有干扰物4）SPE柱流速降低或阻塞二、酸性氧化铝固相萃取柱特点酸性氧化铝的pH约为5，具有很高的活性，用酸洗氧化铝可以使其吸附碱性化合物的能力下降，酸性氧化铝主要用于吸附极性化合物或具有阴离子官能团的化合物。三、阳离子交换柱特点阳离子交换柱，是在高纯度的惰性硅胶表面键合一种新型的聚合磺酸基阳离子交

9、换配位体。这种独特的键合结构是一种稳定的聚合包膜结构，比普通的聚合物离子交换柱柱效更高，且具有更好的机械强度和重现性。其特点如下：4.在适用的pH范围内，具有极好的稳定性边学边练一、任务：酸性氧化铝固相萃取柱和阳离子交换柱在兽药检测中的应用实验样品：海虾参考标准：国家标准GB/T 20361-2006 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法二、操作技术要点：1、净化1）活化。将PRS柱安装在固相萃取装置上，并分别编号，上端连接酸性氧化铝固相萃取柱，用大约两管共5mL乙腈对柱子进行活化，一管即为液面刚好达到萃取柱的柱口。为加快活化速度，应打开真空泵，注意调节固相萃取仪上的流

10、速旋钮，使两个柱子中的溶液保持成滴流下，不能出现成线流下的情况，以免影响柱效。2）过柱。用巴氏管转移所有的孔雀石绿、结晶紫提取液到柱上，控制流速使其成滴流下。再用乙腈洗浓缩瓶两次，每次大约，采用漩涡振荡使内容物完全溶解，依次过柱，注意控制柱子中样液的流速为成滴流下，以使样液有足够的时间和萃取剂发生作用。待样液全部滴完，先关闭流量控制旋钮，再关闭真空泵。弃去酸性氧化铝柱。注意，不论下方的PRS柱是否流干，只要上方的酸性氧化铝柱流干以后，就可以将其拿掉。 将下方的PRS柱取下放到氮吹仪上，调整氮吹针距柱的填料表面1cm左右，调整合适的氮气流量，吹至近干。接着将10 mL乙腈与乙酸铵溶液混合，准备进

11、行洗脱。然后将吹干的固相萃取柱再装到固相萃取仪上，在三根柱子下方放入三根10 mL具塞试管。然后分别在三根柱子中加入2.5 mL上述等体积混合的乙腈和0.1 mol/L乙酸铵溶液进行洗脱，收集洗脱液。刚开始洗脱时不开真空泵，目的是防止洗脱液流速过快，与PRS柱上吸附的样品交换不够彻底。当流速开始变慢时，可以将真空泵打开。洗脱完成后，在具塞试管中，用乙腈将样液定容至2.5 mL。最后，将标样转移至样品瓶中，待测。加样用的巴氏管要先润洗。再用注射器将样液从具塞离心管中吸出，取掉针头，接上m滤膜，将样液匀速过滤入1.5 mL自动进样器样品瓶中，待测。注意注射器在丢弃的时候，必须盖上针盖，避免引起危险

12、。过滤的时候，速度要均匀，不能太快，以免膜破裂。拓展阅读应用智能专家系统软件建立并优化固相萃取方法：建立并优化一个固相萃取方法需要考虑许多因素。这对于一般的分析工作者而言，在开始阶段是有一定难度的。目前，市场上已经有一些商品化的智能专家系统软件能够帮助我们在较短的时间里初步建立一个固相萃取方法，并可以根据该方法的实验结果给出对方法优化的建议。例如美国Phenomenex公司的Sanlple Preparation Method Development Software(建立样品制备方法软件)。 该软件的操作十分简单，使用者只需将样品的信息输入软件，就可以得到相应的固相萃取方法。下面我们以尼古丁

13、的固相萃取为例，对该智能专家系统软件的操作进行介绍。 启动该软件后，首先进入样品信息窗口。在样品基质(sample matrix)栏中，根据样品基质选择相应的表述，例如：血浆(plasma)、全血(whole blood)、尿液(urine)、组织萃取物(水溶液，tisstle extract aqueous)、组织萃取物(水溶性溶剂，tisstle extract water so1uble solvent)、生物组织萃取物(其他溶剂，other solvent)、水(water，<10 mgL)、水(water，1050mgL)、水(water，50200 mgL)、水(water，

14、>200 mgL)等。然后，选定过柱样品体积。根据最后的检测手段，选择洗脱溶剂的类型：100有机溶剂、可以有水或符合GC要求。另外，根据分析的要求，确定萃取方法是针对指定化合物(compotmd specific method)还是用于快速筛选分析(high throughputscreer、)。在输入完样品基质信息后，接着就是要输入目标化合物的信息。这些信息包括：目标化合物的芳香性、pH稳定性、分子式以及相关官能团的信息。在相关官能团详细信息中，可以选择分子结构图(Use Molfile)、结构(Enter struct ures)或pKa lg P(即lg Kow)(Enter 1g

15、 PpKa)。之后，点击右下角的Create SPE Metlod红色键，软件就给出了初步的SPE方法。 使用的固相萃取方法，包括SPE柱种类以及柱预处理、柱平衡、样品过柱、柱洗涤以及最后的洗脱步骤所使用的溶液以及体积。用鼠标点击每一步骤，可以显示更进一步的信息。例如：萃取柱的类型、液体过柱的流速等。点击软件对话框右下角的蓝色Publish按钮，可以将所输人的相关信息及固相萃取方法以Word文档方式存档及打印。 如果根据所建立的初步方法进行实验，结果没有达到预期的目标，可以点击Troubleshoot按钮，该软件可以给出相应的参考解决方案。例如，回收率偏低，软件要求实验人员判断是显示的哪个因素导致回收率偏低，软件就会给出相应的建议。这个过程相当于我们