AT2对成年压力超负荷性肥大心肌细胞TNFα、IL1β及IL6分泌的调控

1、AT2对成年压力超负荷性肥大心肌细胞TNF、IL1及IL6分泌的调控    论文既是探讨问题进行科学研究的一种手段，又是描述科研成果进行学术交流的一种工具.    Call no man happy until he dies.                作者：周娟，徐心，刘进军，林元喜，高广道【摘要】  目的 观察AT2对肥大心肌细胞炎症因子合成的调控

2、作用及AT1和AT2间的相互关系。方法 采用腹主动脉缩窄法构建SD大鼠压力超负荷性心肌肥大模型。选用术后8周肥大的心肌细胞，将其分为Ang组、Ang+losartan组、Ang+PD123319及Ang+losartan+PD123319组。待实验结束，RTPCR法检测细胞TNF、IL1及IL6的mRNA表达水平，放免法检测TNF、IL1及IL6的蛋白表达()。结果 与Ang组相比，AT1拮抗剂losartan不影响TNF和IL1的mRNA及蛋白表达。单独应用AT2拮抗剂PD123319及联合应用losartan和PD123319均可使TNF和IL1的mRNA及蛋白表达水平

3、下调。联合应用二者TNF和IL1 mRNA的表达水平介于单独应用losartan和PD123319组之间。与Ang单独联用losartan或PD123319相比，同时联用二者可使IL6 mRNA的表达水平上调。结论 AT2参与了肥大心肌细胞炎症因子的表达调控。AT1与AT2之间并非简单的拮抗关系。 【关键词】  心肌细胞；血管紧张素二型受体；肿瘤坏死因子；白介素1；白介素6The love of money is the root of all evil.  ABSTRACT: Objective 

4、60;To investigate the role of AT2 in inflammatory factor synthesis of adult hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure overload and the relationship between AT1 and AT2. 

5、Methods  The left ventricular hypertrophy induced by pressure overload was achieved by placing a band around the abdominal aorta. We isolated and purified hypertrophic cardiom

6、yocytes at 8 weeks after operation. The cardiomyocytes were randomly divided into 4 groups: Ang, Ang+losartan, Ang+PD123319 and Ang+losartan+PD123319 groups. The mRNA levels of TNF

7、, IL1 and IL6 were detected by RTPCR and the protein expression of TNF, IL1 and IL6 in medium were detected by radioimmunoassay. Results  Compared with that of&

8、#160;the Anggroup, losartan could not influence the mRNA and protein expression of TNF and IL1, but PD123319 decreased them severely. The mRNA and protein expression of T

9、NF and IL1 also decreased with losartan and PD123319 treatment, but they were higher than in PD123319 alone treatment group. Compared with the Ang, Ang+losartan and Ang+P

10、D123319 groups, the IL6 mRNA increased when cells were treated with losartan and PD123319 simultaneously. Conclusion  AT2 can regulate the expression of inflammatory factors o

11、f hypertrophic cardiomyocytes. The relationship between AT1 and AT2 is not only antagonistic.Nature is the glass reflecting truth.  KEY WORDS: cardiomyocyte; angiotensinreceptor 2 (AT2); TNF; IL1;

12、0;IL6作为心血管系统关键性调控因子的血管紧张素(angiotensin, Ang)在心肌中主要有型受体(AT1)和型受体(AT2)(医药学/临床医学论文 )。已证实，AT1可介导心肌细胞肥大、成纤维细胞的增殖以及胶原的合成，从而诱发心肌重构，而AT2的功能至今尚不完全清楚。大多学者认为AT2可以拮抗AT1的效应，但近来也有研究结果与此相异12。    研究提示，在多种心脏疾病中表达增多的炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白介素1(interleukin1,&#

13、160;IL1)及白介素6(interleukin6, IL6)3等在疾病的发生发展中均具有广泛的病理生理作用。TNF、IL1及IL64均可以引起明显的细胞肥大效应：暴露于IL1和IL6的心肌细胞不仅蛋白质合成增加，一些胎儿期基因，如心房利钠多肽(atrial natriuretic peptide, ANP)及肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MHC)的表达也明显增加56；心脏过表达TNF的转基因小鼠不仅存在心肌细胞的肥大和功能异常，其心力衰竭和死亡的发生率也明显增加7。此外，IL6及TNF等还具有明显

14、的负性肌力作用，从而抑制心脏的收缩功能；慢性心力衰竭患者体内IL1和TNF含量的升高与室壁应力增加间的相互作用，共同参与了疾病的发生8。   Ang及其两型受体在肥大的心肌细胞中的相互作用以及其对细胞因子表达及释放的影响目前还较少涉及。因此，本实验以压力超负荷性肥大心肌细胞为研究对象，探讨AT1和AT2对肥大心肌细胞炎性细胞因子表达的调控作用，同时观察AT1与AT2之间的相互关系。Answer a fool according to his folly.  1  材料与方法1.1  实验动物  

15、雄性SD大鼠，体重220-250g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。  1.2  药品及试剂  Ang、PD123319、洛沙坦(losartan)、型胶原酶(collagenase)、型胶原酶(collagenase)及牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)为Sigma公司产品；M199培养基为GIBCO公司产品；Trizol 及Taq酶为Promega公司产品；dNTPs及100bp DNA Ladder为华美生物工程公司产品；引物由上海康成生物技

16、术有限公司合成；放免试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。  1.3  压力超负荷性心肌肥大模型的构建  将实验动物随机分为2组：腹主动脉缩窄(aortaconstriction, AC)组，于左肾动脉上方小心分离长约3mm的腹主动脉，套以内径为0.8mm的银夹造成缩窄；假手术(shamoperation, SO)组，除不以银夹缩窄腹主动脉外，其余操作同AC组。手术后饲养8周处死取材。1.4  心肌肥大指数测定  测取左心室湿重(包括左心室游离壁和室间隔)，计算左心室重与体重比值(

17、left ventricle/body weight ratio, LV/Bwt)作为心肌肥大指标。作HE染色切片，使用目镜测微尺测量心肌细胞横径(left ventricular cardiomyocytes transection diameter, LVTDM)。高倍镜下(10×40)随机选取20个横纹清晰、胞核完整、形状规则的心肌细胞，测其横径，取其均值作为心肌肥大另一指标。Wine and judgement mature with age.  1.5  

18、心肌细胞的分离及培养  采用胶原酶Langendorff灌流法获取所需手术组肥大心肌细胞。并将分离所得心肌细胞置于含有2g/L BSA、5mmol/L肌酸、5mmol/L牛璜酸、2mmol/L肉毒碱、100u/mL胰岛素、100u/mL青霉素以及100g/mL链霉素的M199培养基中培养。细胞随机分为：Ang组(终浓度10-6mol/L)；Ang+AT1受体拮抗剂losartan组(用终浓度10-5mol/L的losartan预处理1h后加入Ang)；Ang+AT2受体拮抗剂PD123319组(用终浓度10-5mol/L的PD123319预处理1h后加入Ang)；

19、Ang+losartan+PD123319组(用losartan和PD123319同时预处理1h后加入Ang)。处理因素作用24h后，RTPCR检测细胞TNF、IL1及IL6的mRNA水平；另培养的肥大心肌细胞同样分组干预36h后收集培养液上清，放免法检测其中TNF、IL1及IL6的蛋白表达水平。1.6  RTPCR  一步法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增。条件为：94变性1min，退火1min，72延伸1min，共30个循环，于72再延伸5min。引物序列、产物长度及退火温度见表1。以actin作为内参照，用三者凝胶成像后的灰度值与ac

20、tin相比，代表三者的相对表达水平。1.7  放射免疫检测分析  按放免试剂盒操作步骤进行。Wine and judgement mature with age.  1.8  统计学分析  数据以±s表示，SPSS12.0统计分析软件，各组间相互比较分析采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。2  结果2.1  模型构建及结果  缩窄大鼠腹主动脉8周后，左心室重/体重比值明显增大，

21、HE染色切片显示模型组左室心肌细胞横径增加，提示心肌细胞明显肥大(表2)。表1  RTPCR引物序列、退火温度及产物长度（略）Table 1  Sequence, expected fragment size and annealing temperature of each PCR primer and product表2  左心室重/体重比和心肌细胞横径（略）Table 2 

22、0;The LV/Bwt and LVTDM(n=8)*P<0.05 vs. SO group. SO: shamoperation; AC: aortaconstriction; LVTDM: left ventricular cardiomyocytes transection diameter; LV/Bwt: left ventricle/ body weight 

23、;ratio2.2  AT1和AT2对压力超负荷性肥大心肌细胞TNF、IL1及IL6表达的调控  在mRNA水平上与Ang组相比，AT1拮抗剂losartan不影响Ang诱导的肥大心肌细胞TNF和IL1的表达，而AT2拮抗剂PD123319可显著下调二者的表达。同时应用losartan和PD123319也可使Ang诱导的肥大心肌细胞TNF和IL1的表达下调，但其水平介于单独应用losartan和单独应用PD123319之间。与Ang组相比，单独联用losartan或PD123319均不影响肥大心肌细胞IL6的表达。但较Ang组、单独应用losartan或

24、PD123319组，同时应用二者却可使IL6的mRNA表达水平显著升高(表3、图1-3)。表3  肥大心肌细胞中TNF、IL1及IL6 mRNA的表达（略）Table 3  The mRNA expression of TNF, IL1 and IL6 of hypertrophic cardiomyocytes*P<0.05 vs. Anggroup; #P<0.05 vs.

25、0;Ang+losartan group; P<0.05 vs. Ang+PD123319图1  压力超负荷性肥大心肌细胞中TNF mRNA的表达（略）Fig.1 Expression of TNF mRNA in hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure overloadM: marker; A: Ang; B:An

26、g+losartan;C: Ang+PD123319; D: Ang+losartan+PD123319图2  压力超负荷性肥大心肌细胞中IL1 mRNA的表达（略）Riches do not always bring happiness.  Fig.2 Expression of IL1 mRNA in hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure overload

27、  M: marker; A: Ang; B:Ang+losartan;C: Ang+PD123319; D: Ang+losartan+PD123319图3  压力超负荷性肥大心肌细胞中IL6 mRNA的表达（略）Fig.3 Expression of IL6 mRNA in hypertrophic cardiomyocytes induced by pressure ov

28、erloadM: marker; A: Ang; B:Ang+losartan;C: Ang+PD123319; D: Ang+losartan+PD123319   在蛋白质水平上，与Ang组相比，losartan不影响肥大心肌细胞TNF和IL1的表达，单独联用PD123319或与losartan合用均可使TNF和IL1的表达下调。联合联用二者与单独联用losartan组相比，IL1的表达也有所下调。    因培养液上清中IL6的含量过低，实验中采用的方

29、法未能检出。因此，以上mRNA水平上IL6的相关结果，在蛋白水平上未观察到(表4)。 论文教育信息网  If you run after two heares, you will ca.  表4  放免法测定肥大心肌细胞中TNF、IL1及IL6的蛋白表达（略）The farmers are the founders of civilization and prosperity.  Table 4  The protein expression of TNF,

30、0;IL1 and IL6 of hypertrophic cardiomyocytes*P<0.05 vs. Anggroup; #P<0.05 vs. Ang+losartan group3  讨论    经腹主动脉缩窄8周，SD大鼠左心室重/体重比值明显增大，左室心肌细胞横径增加约45%，表明我们获得的确为肥大心肌细胞。有资料表明，Ang可以促进正常心肌细胞合成TNF，且用losartan预处理可明显减少培养

31、液中的TNF含量9，说明此过程由AT1介导。但本实验结果显示，阻断AT1并不能显著影响压力超负荷性肥大心肌细胞TNF的表达，而AT2拮抗剂PD123319却可以显著下调TNF mRNA及蛋白表达水平。同时，也对在心肌重塑中同样起重要作用的IL1和IL6进行了观察。结果表明：在压力超负荷性肥大心肌细胞中对IL1起主要调控作用的仍为AT2，阻断AT2可使其表达明显下调。因细胞培养上清液中浓度过低，我们未能检测出各组培养液中IL6的蛋白表达水平。而有关AT2受体通过激活NFB通路参与组织和器官炎症过程的现象，在肾脏和血管平滑肌细胞中也已经得到了证实。分析实验结果可能由于：其他学者的研究对象

32、多为新生大鼠心肌细胞，而已知新生大鼠与成年大鼠心肌细胞表型的特性存在着明显的差异，建立在新生大鼠心肌细胞的实验结果不能完全等同于成年大鼠心肌细胞；正常与压力超负荷性肥大心肌细胞表面AT1与AT2受体的表达量明显不同，而且压力超负荷性肥大心肌细胞本身已存在明显的形态和基因改变，因而建立在正常大鼠心肌细胞上的实验结果也不能完全等同于已经发生肥大的心肌细胞。    目前大多研究者认为AT2可以对抗AT1介导的心肌细胞生长效应1011，且阻断AT1抑制细胞肥大过程至少有部分是通过同时活化的AT2介导的12。然而，也有实验结果显示二者之间也可能存在着协同关系：Ry

33、ckwaert等采用成年雄性Wistar大鼠研究心脏AT2与AT1在缺血再灌注中的作用。结果表明AT2与AT1的作用具有累积效应，因为同时阻断两种受体比单纯阻断任何一种受体都更能促进心功能的恢复1；另一研究小组的实验结果也证实：联合应用losartan 和PD123319较之单独应用任一拮抗剂都更能降低胰岛素引起的低血糖大鼠血浆中肾上腺素的浓度2。    而本实验结果则提示AT2与AT1之间的关系较为复杂。在mRNA水平上，与Ang组相比，单独联用PD123319虽可明显下调TNF及IL1的表达，但同时联合应用losartan 和PD

34、123319却使下调的mRNA有所上升，提示在对压力超负荷性肥大心肌细胞TNF及IL1mRNA的表达调控中AT1与AT2之间可能存在拮抗关系。同样，在mRNA水平上，与Ang组相比，单独联用losartan或PD123319均不能显著影响IL6的表达，但同时联合应用losartan和PD123319却可使其表达水平升高，提示在对压力超负荷性肥大心肌细胞IL6 mRNA的表达调控上AT1与AT2之间可能存在着协同关系。由于蛋白质的表达还存在转录后翻译等多个环节，因而其差异不如mRNA水平上的结果显著。因此，相比之下mRNA水平上的结果可以更为清楚的阐明压力超负荷性肥大心肌细胞中AT2与

35、AT1之间的相互关系。而有关AT2在心肌重塑中的作用还有待于进一步的深入研究。    总之，本实验结果表明，AT2参与了压力超负荷性肥大心肌细胞中细胞因子TNF、IL1及IL6表达的调控。AT2与AT1之间的关系较为复杂，二者之间并不是简单的拮抗关系。【参考文献】  1Ryckwaert F, Colson P, Guillon G, et al. Cumulative effects of AT1 and 

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38、60;T, Takahashi T, et al. Interleukin6induced reciprocal expression of SERCA and natriuretic peptides mRNA in cultured rat ventricular myocytes J. J Int Med Res, 2004, 32(1):5

39、761.5Ng DC, Long CS, Bogoyevitch MA. A role for the extracellular signalregulated kinase and p38 mitogenactivated protein kinases in interleukin1 betastimulated delayed signal tranducer

40、 and activator of transcription 3 activation, atrial natriuretic factor expression, and cardiac myocyte morphology J. J Biol Chem, 2001, 276(31):2949029498.6Tanaka T, Kanda T, Itoh

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