HYQ spin 质粒提取试剂盒- HG101-

1、 HYQspin TM质粒DNA小提试剂盒试剂盒组成Catalog#HG10101HG10102HG10103规格1050250Buffer BS6mL30mL150mL Buffer B1*3mL15mL80mL Buffer B23mL15mL80mL Buffer B35mL25mL100mL Buffer KS6mL30mL150mL Buffer DWS3mL15mL3x24mL Buffer ES2mL10mL30mL(20µL(100µL25mg(500µLDNA Columns1050250说明书111 *使用前将提供的所有RNase A全部加入B

2、uffer B1中,4贮存。产品介绍:本试剂盒采用Qbiosource公司自主开发吸附系统,通过采用离心柱高效可逆专一吸附DNA,继而用Buffer KS和DWS除去蛋白和其他杂质,最后用Buffer ES把核酸洗脱下来的方法快速纯化质粒DNA。使用本试剂盒提取质粒,有操作简单、得率高、纯度高、重复性好等优点。产品特征:样品14mL大肠杆菌类型离心柱收益率高拷贝数的质粒8to15µg/ml菌液操作离心应用克隆/亚克隆RFLP,测序,转染HEK293等细胞储存条件:本试剂盒自购买之日起,可以保存12个月。其中RNase A试剂应保存在4,其他组分室温(22-25°C保存。实验

3、准备:请按照说明书准备所需的试剂和耗材,熟悉每一步操作和注意下列事项:RNase A:50mg/mL.50mg/mL的RNA酶,室温下可稳定贮藏三个月,长期贮藏请置于4保存。使用前将提供的所有RNase A离心后加入Buffer B1,然后将加了RNase A的Buffer B1置于4保存。Buffer B2和Buffer BS在低于室温时会沉淀,如有浑浊现象,使用前请于50左右水浴加热至沉淀完全溶解,溶液澄清。使用前请向Buffer DWS中加入无水乙醇Catalog#无水乙醇HG1010112mLHG1010260mLHG1010396mL使用后保证Buffer B2瓶盖旋紧用户自备材料:

4、高速离心机无水乙醇操作步骤:大肠杆菌培养和收集1.从新鲜的平板上接种单个菌落到1-5mL的含适量抗生素LB培养基中,37震荡培养14-16小时。*不建议过度培养(>16小时,因为大肠杆菌会降解而且质粒的产量会降低。*不要直接转接甘油冻存的菌。*对于在LB培养基中培养的大肠杆菌上述操作步骤是最佳的,当使用TB or2xYT培养基时,一定要确保细菌的密度OD600不要超过3.0。如果菌液过多,按比例相应的增加Buffers。质粒DNA纯化2.向离心柱中加入500µL Buffer BS,12,000rpm离心30s。*此步骤为可选步骤,一般情况下,省略此步骤也能得到理想的回收效果。

5、但当吸附柱存放时间较长时,可能出现吸附能力下降的现象,通过使用Buffer BS,可以使吸附柱恢复最佳的吸附能力3.10,000rpm离心30s,收集菌体,尽可能吸去上清,把管子倒扣在吸水纸上完全除去残留的培养基。*残留的液体培养基容易导致菌液裂解不充分,DNA产量低,并可能导致第6步离心后沉淀较松,不能有效吸取上清。4.加入250µL Buffer B1(确保已加入RNase A,用移液枪或涡旋震荡器充分悬浮细菌细胞。*细菌如果没有充分悬浮均匀,将导致菌体裂解不完全,从而降低产量。5.加入250µL Buffer B2,轻轻地反转10次以混合均匀(不要涡旋,然后室温静置2

6、5min至溶液粘稠而澄清。*静置时间不超过5min。*Buffer B2在低于室温时会沉淀,如有浑浊现象,使用前请于50左右水浴加热至沉淀完全溶解,溶液澄清。6.加入350µL Buffer B3,温和并充分地混匀,至产生大量白色絮状沉淀。*冰上放置1分钟有利于提高产量。*混合液一定要混匀,若混合液仍然是粘稠的球状,再多混合几次直到出现白色絮状沉淀。7.将离心管转至高速离心机,12,000rpm离心10min。*若上清中有白色沉淀,可转移至一干净离心管再次离心5min。8.小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA吸附柱中(避免吸起沉淀,室温静置1min,12,000rpm离心30s

7、,弃废液,将吸附柱重新放回到收集管中。9.向DNA吸附柱中加入500µL Buffer KS,室温静置1min,12,000rpm 离心30s,弃废液,将离心柱重新放回到收集管中。*此步为可选步骤,可以进一步去除残留的蛋白,对DH5a、Top10等endA-宿主菌可以省略,但对富含内源核酸酶的宿主菌(endA+,如HB101,JM101,TG1等来说是必须的。9.向离心柱中加入600µL Buffer DWS(确保已加入无水乙醇,室温静置1min,12,000rpm离心30s,弃废液,将吸附柱重新放回到收集管中。10.重复步骤“9”。11.12,000rpm离心2分钟,以彻

8、底去除残留的乙醇。*此步骤中开盖离心将会更有效的去除残留的乙醇。 12.将离心柱转至一个新的1.5 mL离心管中，向 DNA吸附柱的正中间加入 30-100 µL Buffer ES ，室温放置 1min ， 12,000 rpm 离心 1min ，洗脱质 粒DNA。 *将 Buffer ES 预热到 60 ，或加入 Buffer ES 后将柱子整个温育 5 分钟 后再离心洗脱可以增加 DNA 回收效率。 *对大于 8kb 的片段，加入 Buffer ES 后将柱子整个温育 15 分钟后再离心 洗脱可以提高回收效率。 *第一次洗脱可以回收离心柱DNA结合量的 60-70% ，将洗脱液

9、重新上柱 可以回收额外 20% ，两次洗脱总回收量可达90% Page 6 HYQspinTM 质粒 DNA 小提试剂盒 常见问题分析： 问题 得率低 可能原因/建议 细胞重悬不完全 *用涡旋振荡器彻底悬浮菌团，然后再加 Buffer B2 * 确保 Buffer B2 新鲜，使用完要立即旋紧瓶盖 (Buffer B2: 0.2M NaOH and 1%SDS 细菌过度培养或者不新鲜 * 细菌培养时间一般 12-16 小时，离心收菌，若当天不提取 请保存在 -20 °C冰箱， 不要4°C冰箱过夜保存 质粒拷贝数低 *增加菌液体积和Buffer B1, B2, B3 的体积

10、基因组 DNA 污染 加入 Buffer B2作用时间过长 *加入 Buffer B2不要涡旋或者剧烈震荡 *加入 Buffer B2后作用时间不要超过5分钟 RNA 污染 Buffer B1中未加入RNase A *把 RNase A加到Buffer B1中 质粒丢失 质粒没有转进宿主菌中 *重新转化质粒或使用不同的宿主菌 琼脂糖凝胶电泳时质粒 DNA浮出胶孔, DNA 冻 存不结冰或者有乙醇气 味 残留的乙醇未完全除去 *在洗脱质粒DNA前确保离心柱中不残留乙醇，若需要可以 再次离心以确保乙醇除尽 HYQspinTM 质粒 DNA 小提试剂盒 Page 7 质量保证 : 所有的 HYQ 产品都经过