P. yoelii 17XL感染小鼠Treg影响Th应答特点的实验研究

1、P. yoelii 17XL感染小鼠Treg影响Th应答特点的实验研究1 引言疟疾是疟原虫通过媒介昆虫蚊传播的人类最为严重的寄生原虫感染性疾病。据WHO 报告，全球约40%的人受到疟疾威胁，每年约3.5-5 亿人感染，因疟疾而死亡的儿童可超过100万1。疟疾的流行已成为全球性最严重的三大公共卫生问题之一，给全球尤其是发展中国家带来了严重的健康危害和沉重的经济负担2。因此，研制安全、价廉和有效的疟疾疫苗是人类控制乃至根除疟疾的重要途径，也是当今世界迫切需要解决的重点课题。而疟原虫感染宿主机体应答的免疫学、分子生物学等综合基础研究是其重要前提。关于红内期疟原虫感染的免疫机制，其他学者及我们前期的研

2、究结果均已证实36：CD4+T 细胞在抵抗红内期疟原虫感染过程中发挥至关重要的作用。在疟疾感染早期，DC 产生IL-12 诱导以IFN-分泌增加的Th1 型细胞免疫应答，增强巨噬细胞的吞噬活性，并通过TNF- 及NOs 遏制疟原虫的爆发性增殖；随之，由Th2 型细胞辅助B 细胞产生特异性抗体，有效地清除疟原虫，防止复发和再燃。CD4+CD25+调节性T 细胞（regulatory T cells，Tregs）是体内天然存在的具有独特调节功能的细胞亚群3。Tregs 不同于Th1 和Th2，具有广泛的免疫抑制性，通过表面膜分子与其他细胞直接接触或分泌抑制性细胞因子IL-10 和TGF-等方式，抑

3、制体内CD4+T 细胞等多种免疫细胞的活化和增殖7, 8。实验研究显示，疟原虫感染中Tregs 的参与可能影响了宿主Th1/Th2 型细胞免疫应答的有效建立和协调过度9。本研究利用建立的P.y17XL 感染DBA/2 和BALB/c 小鼠模型，对比分析疟原虫感染宿主免疫应答的变化特点与Treg 数量变化之间的关系，以期确立Tregs在调控保护性和病理性免疫应答中的效应机制，为疟疾等感染性疾病的有效控制提供新的理论依据。2 材料与方法2.1 疟原虫及实验动物感染68 周龄、雌性DBA/2 和BALB/c 小鼠（中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证编号：SCXK 京2004-0001），经腹腔

4、感染1106 P.y17XL（日本爱嫒大学分子寄生虫学教研室惠赠）寄生的红细胞。于感染后不同时间采小鼠尾静脉血，制备薄血膜，Giemsa 染色，计数红细胞感染率。2.2 脾细胞培养无菌取出感染0d、1d、3d、5d、8d、10d、12d 和15d 的小鼠脾脏，用FCS-RPMI 1640培养液制成细胞悬液，350g 离心10min，用0.17 M NH4Cl 裂解红细胞，RPMI 1640 洗涤两次。以含10% FCS-RPMI 1640 调整脾细胞终浓度为1107/ml，于24 孔培养板上加入细胞悬液，500l/孔，以RPMI-1640 为对照，于37C 培养48h。350g 室温离心10m

5、in，收集上清，-80C 保存，待IFN- 和IL-4 检测。2.3 IFN- 和IL-4 检测用双抗体夹心ELISA 法对小鼠脾细胞培养上清的IFN- 和IL-4 的含量分别进行检测，酶标仪检测450nm 处OD 值。应用SoftMax Pro4.3.1 LS 软件分析，绘制标准曲线，计算细胞因子含量（pg/ml）。2.4 流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+T 细胞数量每份样品用CD4-FITC 单抗（clone GK1.5）、CD25-PE 单抗（clone 3C7）和Foxp3-APC单抗（clone FJK16s）进行三色分析，另设阴性对照管。流式细胞仪专用染色管预先加入Fc

6、III/II 封闭抗体，取新鲜制备的1 106 / ml 脾细胞悬液0. 1 ml，37C 条件下PMA 和伊屋诺霉素刺激2h 后加入Golgi Stop 共同培养4h，3%FCS 洗涤后加入FITC-anti-CD4 andPE-anti-CD25 荧光抗体孵育30min，3%FCS 洗涤后加入固定透膜剂孵育，然后加入APC-anti-Foxp3 荧光抗体进行细胞内染色。同时用FITC rat IgG2b 作为同型对照。利用流式细胞仪( FACSCalibur，美国B&D 公司)，使用前向散射角（FSC）及侧向散射角（SSC）确定淋巴细胞群，应用FACSCELLQUEST 软件，每个样品分析

7、10000 个细胞，以阴性对照为参考，将对照管所示的非特异荧光的99%以上作为本底扣除，以二维点阵图显示，记录Tregs的百分率。2.5 统计学处理应用SPSS 11.5 统计学分析软件，双尾t 检验分析比较各组间的统计学差异。3 结果3.1 P.y17XL 感染小鼠原虫血症水平及生存率P.y17XL 感染后第2 d，两种小鼠外周血涂片均查到疟原虫；感染后第3 d，红细胞感染率均为2%4%。随后，BALB/c 小鼠原虫血症水平迅速升高，感染后第5 d 红细胞感染率50%，感染后第5 d 及次日小鼠全部死亡；DBA/2 小鼠原虫血症水平上升缓慢，感染后第9 d红细胞感染率峰值为34%，观察期内小

8、鼠全部存活。3.2 P.y17XL 感染小鼠不同时间IFN- 分泌水平P.y17XL 感染的BALB/c 小鼠脾细胞上清中IFN- 水平仅在感染后第3d 出现一过性有意义的升高（P0.01)；而DBA/2 小鼠IFN- 水平在感染后第1d 开始出现有意义的升高，第3d 达峰值（P0.01)，是同天感染BALB/c 小鼠的5.4 倍，随后在感染后第5d 虽有下调但仍保持有意义的升高，直至感染后第8d 回落至正常水平。3.3 P.y17XL 感染小鼠不同时间IL-4 分泌水平P.y17XL 感染的BALB/c 小鼠脾细胞上清中IL-4 水平仅在感染后第3d 出现有意义的升高，而DBA/2 小鼠IL

9、-4 水平在感染后第5d 开始出现有意义的升高，第8d 达峰值（P0.01)，此后虽有回落但仍维持其高水平，感染后第15d 回落至正常水平。3.4 P.y17XL 感染小鼠不同时间脾Tregs 数量检测P.y17XL 感染小鼠于感染后第1d Tregs 均出现有意义的升高。随后DBA/2 小鼠Tregs缓慢上升，感染后第5d 达峰值约占CD4+T 细胞的14（P0.01），然后又开始缓慢下降，小鼠全部存活；而BALB/c 小鼠Tregs 数量迅速上升，感染后第5d 达峰值约占CD4+T 细胞的38（P0.01），小鼠全部死亡。4 结论关于红内期疟原虫感染的免疫机制，无论鼠疟模型和人体试验研究结

10、果均已证实：CD4+T 细胞在抵抗红内期疟原虫感染过程中发挥至关重要的作用，Th1-Th2 连续活化是确保保护性免疫效应发挥的关键10, 11。Th1/Th2 之间的平衡及协调不但能够控制急性期的危象，而且最终能够清除疟原虫。本实验结果发现，P.y17XL 感染的DBA/2 和BALB/c 小鼠在感染过程中，免疫应答存在明显差异性。原虫血症水平作为反映疟原虫红内期感染状况的直接的特征性指标显示，在P.y17XL 感染3d 后，BALB/c 小鼠的原虫血症水平迅速持续上升，至感染后第5d 高达近50%而全部死亡；同时IFN- 和IL-4 分泌水平仅在感染后第3d 出现一过性有意义的升高，而且峰值

11、较低；与之相比，DBA/2 小鼠的原虫血症水平上升较为缓慢，且峰值较低，于感染后第9d 原虫血症达峰值仅为32%；IFN- 分泌水平在感染后第3d 达峰值，并且直至感染后第8d 一直维持较高水平，而IL-4 分泌水平在感染后第8d 达峰值，并且直至感染后12d 始终保持较高水平；由此可见，P.y17XL 感染的DBA/2 小鼠能够在感染过程中建立有效的Th1 和Th2 型细胞免疫应答，并且保护性免疫应答能有效地从Th1 向Th2 型应答过渡，感染小鼠全部存活；相反，BALB/c 小鼠未能建立有效的Th1 应答控制红内期疟原虫的爆发性增殖，导致最终死亡的感染结局。为进一步确定Tregs 与Th1

12、/Th2 应答建立和转化的相关性，我们观察了Tregs 的数量变化。本实验结果显示，P.y17XL 感染的DBA/2 小鼠IFN-在感染后第3d 出现明显高水平增高的同时Tregs 数量仅出现一过性低水平增加，并于感染5d 后恢复正常水平，而且IL-4 在感染后第8d 也出现高水平升高。反之，BALB/c 小鼠在感染后第1d Tregs 就出现明显的数量增加，至感染后第5d 异常升高达峰值。与此同时，IFN-和IL-4 水平均在感染后第3d 呈一过性低幅度升高后迅速下降，原虫血症骤然上升。由此提示BALB/c 小鼠的Th1 型细胞免疫应答未能建立与Tregs 数量过早升高的现象密切相关。实验研

13、究发现，消除P.berghei NK65 感染小鼠体内的Tregs 可延缓其疟原虫的生长12；体内消除P.berghei ANKA 感染小鼠的Tregs，可以建立诱导脑疟发生的Th1 型免疫应答13；提示Tregs 可能在疟疾感染过程中发挥重要的免疫调控作用。在此，本研究结果进一步发现，P.y17XL 感染的BALB/c 小鼠Tregs 在Th1 型免疫应答建立的重要时期出现提早升高。由此提示，P.y17XL 易感小鼠BALB/c 难以建立有效的Th1 型细胞免疫应答与Tregs 过早升高密切相关，Tregs 在疟原虫感染过程中介导免疫抑制作用。综上所述，P.y17XL 感染早期，BALB/c

14、 小鼠Tregs 数量的过早升高明显影响宿主的易感性。Tregs 可能与Th1 型细胞免疫应答的有效建立密切相关，其抑制效应有待进一步研究。中国医学论文网专业提供医学论文发表服务，并提供大量医学检验论文，如有业务需求请咨询网站客服人员！参考文献1 Pierce SK and Miller LH. World Malaria Day 2009: What Malaria Knows about the Immune System ThatImmunologists Still Do Not J? J Immunol, 2009, 182(9): 51715177.2 Njau JD, Goodm

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