野菊花高效液相色谱指纹图谱及质量评价方法的建立

1、野菊花高效液相色谱指纹图谱及质量评价方法的建立                              作者：刘婷娜 朱恩圆 侴桂新 王峥涛【摘要】  目的建立野菊花的高效液相色谱指纹图谱及质量评价方法，研究不同采集地和不同种野菊花药材的质量。方法利用RP-HPLC方法，分析了12批市售和8批采自

2、不同产地的野菊花药材。流动相：A相为乙腈，B相为0.1醋酸水溶液，梯度洗脱，流速：1.0 ml·min-1；检测波长：326 nm。结果在45 min内建立了野菊花HPLC指纹图谱，确定了野菊花药材中的22个共有峰,归属了其中的黄酮类化合物，并对其中黄酮类成分进行主成分分析。结论野菊花药材的反相高效液相色谱指纹图谱，重复性好，在野菊花分类学上有一定的指导意义，用于野菊花的质量评价可行。 【关键词】  野菊花 高效液相色谱法 指纹图谱 质量评价    Abstract：ObjectiveTo evaluate the quality of Flo

3、s Chrysanthemi Indici by HPLC fingerprint and the component analysis.MethodsRP-HPLC was used for the determination of fingerprint. The separation was achieved on a C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 m). The mobile phase was a mixture of acetonitrile(A) and 0.01 Acetic acid(B) in gradient elution, the

4、 flowrate was 1.0 ml·min-1, and the detection wavelength was 326 nmResultsThe HPLC fingerprint of Flos Chrysanthemi Indici was set up within 45 minutes and 22 characteristic peaks were shown to compare the flavonoids in different origins and different species in Flos Chrysanthemi Indici. Conclu

5、sionThe RP-HPLC fingerprint method is repeatable, feasible in the quality control of Flos Chrysanthemi Indici and can be used to identify the different species of Flos Chrysanthemi Indici    Key words：Flos Chrysanthemi Indici;  HPLC;  Fingerprint;  Quality evaluation

6、60;   野菊花是我国大部分地区民间常用中草药之一，有清热解毒、平肝明目的功效,秋冬二季花初开放时采摘，晒干或蒸后晒干入药1。2005版药典部规定，野菊花来源于菊科菊属植物野菊Dendranthemae indicum L.的头状花序。而在民间用药中，野菊变种及北野菊D. boreale Mak，菊花脑D. nankingense Hand.-Mazz或岩香菊(又称甘菊) D. lavandulaefolium (Fish)Mak及其变种也做野菊花用2。目前，药材市场上流通的野菊花主要来源于植物野菊和甘菊，或者野菊和甘菊两者混合品。野菊、甘菊两者植物形态相近，鉴定比较困难

7、，质量上难以得到控制。2005版中国药典野菊花含量测定项下仅测定了野菊中蒙花苷的含量，不能对野菊花的质量进行全面准确地评价。本文采用高效液相色谱法对野菊花商品药材和自己采集的不同产地的野菊花药材进行指纹图谱研究，并对其主要活性成分黄酮类成分进行统计学分析，建立野菊花药材质量评价的分析方法，为野菊花药材的质量控制提供有效方法，对进一步提高野菊花的质量评价方法以及在野菊花植物化学分类学上具有一定的指导意义36。    1   仪器与材料    Dionex Summit P680 DGP system 型液相色谱仪，P

8、DA 100二极管阵列检测器，变色龙色谱工作站。对照品：绿原酸购自上海沪云医药有限公司；蒙花苷由上海中药标准化中心提供；木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷（木犀草苷）芹菜素为自制(从野菊D. indicum  L中分离得到，经核磁和质谱鉴定后确定，采用归一化法含量，HPLC检测纯度>98)；乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为纯净水。野菊花购自全国各药店12批和采集自不同产地的8批(采集的药材经过上海中医药大学吴立宏副研究员和安徽中医学院刘守金副教授鉴定，凭证标本存放于上海中药标准化研究中心药材标本室)。药材情况见表12。表1  12批市售野菊花样品的来源 &

9、#160;  2  方法与结果26    2.1  色谱条件与系统适用性色谱柱 Acclaim 120 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 m)；流动相：A相为乙腈，B相为01醋酸水溶液，梯度洗脱，流动相变化比例见表3，流速：1.0 ml·min-1；检测波长：326 nm；柱温；30；进样量：10 l。以木犀草素的色谱峰(12号峰)计算理论塔板数不低于5 000。表2  8批采集得到的野菊花样品的产地及植物来源表3  梯度洗脱流动相的比例    2.2

10、60; 对照品溶液的制备称取木犀草素、绿原酸、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素对照品适量，精密称定，分别置于10 ml量瓶中,精密加入乙腈-甲醇-水（211）溶剂溶解稀释至刻度，制成对照品混标溶液。    2.3  供试品溶液的制备精密称取野菊花药材粉末(过4号筛)0.5 g,置于100 ml三角烧瓶中,精密加入甲醇-醋酸乙酯（11）25 ml, 超声30 min，放冷，补足重量。取续滤液，经微孔滤膜(0.45 m)过滤后，取续滤液制成供试品溶液。    2.4  精密度实验精密吸取野菊花供试品溶液，在上述色谱条件下，重复

11、进样6次，记录色谱指纹图谱。结果表明，各色谱峰与木犀草素内参比峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5.0 ，符合指纹图谱要求。    2.5  重复性实验称取野菊花样品(收集自苏州)6份，按“供试品溶液的制备”项下操作，在上述色谱条件下进样分析，计算各色谱峰与内参比峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD均小于5.0 ，符合指纹图谱要求。    2.6  稳定性实验取供试品溶液，于室温下放置，分别在0，2，4，8，16，24 h进样分析，计算各色谱峰与内参比峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD均小于5.0 ，

12、实验结果表明，野菊花样品溶液在24 h内稳定性良好。    2.7  结果野菊花药材指纹图谱中的特征峰以经形态学鉴定的12批野菊花药材为研究对象，进行指纹图谱研究。共确认了22个色谱峰。通过比对保留时间和紫外吸收图谱的方法，指认了5个色谱峰，分别为绿原酸(1号峰)、木犀草苷(3号峰)、蒙花苷(11号峰)、木犀草素(12号峰)、芹菜素(16号峰)。典型图谱、市售野菊花色谱图、采集得到的野菊花色谱图见图13。1             图1 

13、; 野菊花药材(购自北京)的高效液相色谱图    其中：1，2，4，5，6，7号色谱峰的紫外吸收图与绿原酸相似，应为绿原酸同系物， 3，8，10，11，12，13，16，17，18，19，20号色谱峰为黄酮类化合物。    2.7.1  12批市售药材中黄酮类成分的主成分分析采用多变量统计软件MVSP软件对12批市售药材的色谱数据进行主成分分析。结果如图4。结果可见，市场上大部分药材中的黄酮类成分的组成及含量较为相似，但个别来源的样品相差较多。    图2  12批市售野菊花药材的高效

14、液相指纹图谱    图3  8批采自不同产地野菊花药材的高效液相指纹图谱    2.7.2  8批采集自不同产地的药材黄酮类成分的主成分分析采用多变量统计软件MVSP软件8批采集的药材的色谱数据进行主成分分析，结果如图5。结果可见，产地不同的8批药材聚成了2类，这与野菊花药材的来源主要为野菊和甘菊两类相吻合，并且与根据野菊花植物形态学上的鉴定结果相吻合，说明所建立的野菊花高效液相指纹图谱及黄酮类成分的统计学分析对野菊花植物分类学上有一定指导意义。    图4  12批药材黄酮

15、类成分分析    2.7.2  8批采集自不同产地的药材黄酮类成分的主成分分析采用多变量统计软件MVSP软件8批采集的药材的色谱数据进行主成分分析，结果如图5。结果可见，产地不同的8批药材聚成了2类，这与野菊花药材的来源主要为野菊和甘菊两类相吻合，并且与根据野菊花植物形态学上的鉴定结果相吻合，说明所建立的野菊花高效液相指纹图谱及黄酮类成分的统计学分析对野菊花植物分类学上有一定指导意义。    图5  8批采集自不同产地的药材中黄酮类成分的主成分分析    2.7.3  总收集

16、得到的药材中黄酮类成分的主成分分析采用多变量统计软件MVSP软件对12批市售药材和8批采集得到的野菊花色谱数据进行主成分分析，结果如图6。从市售样品及采集得到的样品色谱数据的聚类分析结果可见，市售样品并不与野菊和甘菊样品聚为一类，而是单独聚为一类，这说明其来源可能为两者都有。    图6  8批采集自不同产地的药材中黄酮类成分的主成分分析    3  讨论    本文采用RP-HPLC梯度洗脱的方法对20批不同来源的野菊花药材进行了指纹图谱研究，对其中的黄酮成分的分离取得了良好的效果。

17、在对20批不同来源的野菊花药材进行色谱分析的基础上在45 min内建立了野菊花的高相液相指纹图谱，并且归属了22个共有峰，其中确定了5个共有峰分别为绿原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素。    提取条件的优化：比较了水提醇沉，80乙醇回流，甲醇超声，醋酸乙酯超声，甲醇与醋酸乙酯不同比例混和溶剂超声。其中醋酸乙酯与甲醇的混和溶剂提取出来的样品色谱峰较丰富，绝大多数色谱峰的紫外吸收均显示为黄酮类成分的特征吸收，且比较了醋酸乙酯甲醇比例为31，21，11，12各种溶剂系统提取得到的样品图谱，结果并无大差别，故选用醋酸乙酯-甲醇11为提取溶剂。比较溶剂超声15，30

18、，45 min的提取效果，结果确认超声提取30 min为提取最佳时间。    检测波长的选择：采用二极管阵列检测器考察200400 nm不同检测波长图谱。结果表明，326 nm的图谱色谱信息丰富，因此选择326 nm为指纹图谱的检测波长。       色谱流动相的选择：经考察甲醇-水溶液、乙腈-水、乙腈-醋酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等多种流动相系统，结果表明，采用乙腈-醋酸水溶液流动相系统，对色谱峰的分离效果最好，各色谱峰均能实现良好的分离，最后确定乙腈-0.1%醋酸水为流动相。    在实验过程中发现绿原酸对照品在溶液状