胰腺癌基因诊断与基因治疗研究进展

1、胰腺癌基因诊断与基因治疗研究进展胰腺癌是消化系统较常见的恶性肿瘤，起病隐匿，恶性程度高。现有的影像学检查及血清学检查尚不能达到早期诊断；其治疗以胰十二指肠切除术为基础，辅以放疗和化疗，预后较差。平均5年生存率低于5，被称为“癌中之王”1。近年来随着分子生物学技术的巨大进步发展起来的基因检测技术为胰腺癌的早期诊断提供了方向，为胰腺癌的有效治疗提供了新的途径。本文就胰腺癌基因诊断和基因治疗的研究进展作简要综述。一、 基因诊断. 胰腺腺癌肿瘤的发生和发展是多个基因异常变化积累的结果。许多原癌基因、抑癌基因以及DNA错位修复基因等，都和胰腺癌有着不可分割的关系。1. 原癌基因1.1 K-ras与胰腺癌

2、有关的ras基因家族主要是K-ras和N-ras。其中以K-ras的点突变研究的最为深入和广泛，可见于90胰腺癌，明显高于其他癌2。但由于K-ras突变也见于一些良性疾病，临床上可作为筛选指标。某些研究发现，用外周血浆检测K-ras突变还可用于评估肿瘤大小、可切除性以及预后3，因此外周血浆检测K-ras基因突变有望成为快速准确诊断胰腺癌的方法。1.2 C-erbB2（Her2/neu）C-erbB2基因编码具酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白Her2/neu，表皮生长因子受体家族成员之一。有结果显示近70浸润性胰腺导管癌过度表达Her2/ neu。正常胰腺导管上皮不表达Her2/neu，82%的平

3、坦型病变导管，86%的乳头状病变导管，92%的有异型的乳头状病变导管上皮表达Her2/neu4。胰腺癌中Her2/neu的强表达可能与肿瘤早期增殖有关，为早期诊断和治疗提供了线索。1.3 Bcl-2Bcl-2的过度表达见于约50%的胰腺癌，可阻止胰腺癌细胞凋亡，导致肿瘤形成。但无转移的高分化胰腺癌的Bcl-2蛋白的表达明显高于有转移的低分化胰腺癌5。1.4 p840以上的胰腺癌过表达p8基因产物，与分化程度、淋巴结转移相关，而与预后无关6、7。其他如Myc、C-fos、c-raf、HLA-DR-和C-met基因都与胰腺癌有较大的关联。2. 抑癌基因2.1 p16P16能抑制细胞周期蛋白D1细胞

4、周期依赖激酶CDK4/6，使细胞稳定的处于G1期，从而破坏整个通路。p16基因失活使活化转录因子释放，促进了细胞周期。约90胰腺癌有p16基因异常8。据美国俄亥俄州大学研究，化学诱导的大鼠胰腺癌中90.3与p16失活有关 8。检测p16基因突变可为胰腺癌早期诊断提供依据。2.2 p53活化的p53上调p21，作用于细胞周期蛋白E/CDK2而避免细胞周期停滞于G1/S期。P53作用的另一个靶基因是其负调控因子MDM2。另外P53蛋白还能诱导细胞凋亡，阻止有癌变倾向的细胞产生8。约4075的胰腺癌肿存在p53基因的异常。血清中53蛋白浓度可用于胰腺癌的诊断及判断肿瘤的进展。2.3 DPC4进化上非

5、常保守的Smad基因家族。产物蛋白是TGF-受体信号传导途径中的必需物质。DPC4的丢失可使细胞过度生长。临床上发现近50胰腺癌都存在DPC4的缺失。DPC4失活被认为是肿瘤发生中的晚期事件。其他如LKB1/STK119、APC和MCC10、DCC11、MPP12 、TGF-超家族13、三联脆组基因FHIT14等也有资料表明其与胰腺癌的发生发展具相关性。端粒酶是细胞核内的核糖核蛋白酶，具有逆转录酶的活性。人正常体细胞端粒酶活性为阴性,而90左右恶性肿瘤细胞端粒酶呈活化状态。Hiyama等报道95的胰腺癌组织中端粒酶活性呈阳性,而11例良性胰腺肿瘤均呈阴性10。因此端粒酶可作为胰腺癌诊断的基因标

6、记物。3.2 BRCA2最近的研究发现具有BRCA2胚系突变的病人其患胰腺癌的危险性明显增加。Goggins等发现在41例胰腺癌中，15例存在BRCA2杂合子缺失，4例存在突变15。近年来的肿瘤研究确立了肿瘤血管生成在肿瘤生成、发展中的地位和作用。肿瘤血管生成相关基因的检测有助于胰腺癌预后的判断，但作为诊断手段尤其早期诊断还需要进一步研究。基因芯片技术是80年代发展起来的新兴技术，是基因突变分析、基因测序和基因表达研究的高效手段，具有高度敏感性、特异性和准确性。利用基因芯片技术可筛选出在胰腺癌中呈特征性表达的基因，作出早期准确的诊断。更重要的是应用基因工程的方法来校正这些变异基因,可达到治愈肿

7、瘤的目的。.其他类型胰腺肿瘤1. 胰腺内分泌肿瘤 研究中发现胃泌素瘤和胰腺内分泌肿瘤中MEN1等位缺失的发生率58.4，突变的发生率23.2。胃泌素瘤的基因半定量PCR分析发现与HER-2/neu相关。胰腺无功能内分泌肿瘤中，大部分有p16的失活， 55的无功能性胰腺内分泌肿瘤有DPC4/Smad4的异常。2. 导管内乳头粘液瘤(IPMT)：65IPMT有K-ras突变（浸润性腺癌90突变），p16和p53杂合子的缺失在浸润性IPMT中明显高于非浸润性IPMT16。二、 基因治疗.基因治疗策略重新引入野生型抑癌基因拷贝修复突变基因的功能，来抑制肿瘤生长或诱导肿瘤细胞调亡，这在高突变率的个体中，

8、并没有很大意义。关键是干扰肿瘤细胞持续性生长的途径。胰腺癌中主要用反义核酸和核酶技术直接破坏癌基因的mRNA的转录。如将含K-ras反义核苷酸的脂质体质粒载体经腹腔注射胰腺癌小鼠模型，获得明显的治疗效果17。将非哺乳动物某些酶通过基因转导入肿瘤部位，再给予无毒性前体药物治疗，其经酶解代谢后的毒性产物在局部具有高浓度，能将肿瘤细胞杀死，而全身反应轻微。在酶解药物前体治疗研究中还发现存在“旁观者效应”，利用已转导的肿瘤细胞杀死未发生基因转导的肿瘤细胞，或抑制其生长。肿瘤的免疫治疗就是诱导及增强抗肿瘤的免疫反应。主要包括应用肿瘤疫苗、转染某些细胞因子基因和利用抗体等对肿瘤进行治疗。以肿瘤疫苗研究较为

9、深入。Schnurr等将胰腺癌细胞提取物载入树突细胞制备抗肿瘤疫苗，避免了单一抗原的局限性，结果表明此种疫苗可以诱导较强的细胞抗肿瘤免疫反应18。Kuo等构建的表达vEGF受体Flk1的病毒载体，通过离体和在体转染胰腺癌细胞，抑制胰腺癌生长19。.基因转导系统肿瘤基因治疗受基因转导载体的限制，包括载体的有效浓度和转导的生物有效性。目前使用的基因转导方法有三种：病毒、非病毒和物理方法。常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒；非病毒载体有裸DNA技术和脂质DNA复合物；物理方法主要有细针注射和电穿孔20。病毒载体仍然是目前最有效的基因转导方法。目前已有用于胰腺肿瘤细胞的逆转录病毒载体，如单

10、克隆鼠白血病病毒（MoMLV）21。腺相关病毒（AAV）载体也已经用于胰腺癌细胞的基因转导22。杂交载体转导是基因转导系统中的转折点。它既保留了原病毒载体的特性，又能解决滴度和免疫应答的问题。.胰腺癌基因治疗的靶基因1. K-ras消除优势途径：Kuzumaki等从原癌基因v-H-ras得到一种突变N116Y，通过脂质体将其导入8种具有K-ras突变的人胰腺癌细胞株后，发现可抑制细胞株的生长，而对正常的细胞则不起作用23。免疫治疗途径：胰腺肿瘤肽可放大抗原递呈效应，细胞毒T细胞（CTL）对突变的ras肽反应，能暂时将胰腺癌细胞株杀死 24。反义RNA及核酶途径：在裸鼠模型中转导含反义RNA的质

11、粒，能抑制胰腺肿瘤的生长17。另外的研究表明，用腺病毒系统转导针对K-ras第12密码子突变的核酶，发现突变的K-ras的mRNA和Bcl-2蛋白明显减少，并且能抑制肿瘤生长和诱导肿瘤细胞凋亡25。2. P16直接在胰腺肿瘤部位或通过门静脉注射含p16的腺病毒载体（Adp16），在切除肿瘤后能抑制肿瘤的转移26。3. P53腺病毒转导野生型p53至胰腺肿瘤细胞，在体内外均能抑制肿瘤细胞的生长。在体内研究中，同时转染p53和p16能提高细胞凋亡的程度。所以至少在胰腺癌模型中，可以得出p53和p16在诱导细胞凋亡上具有协同作用。最近的研究中发现88以上的胰腺癌与CaSm（肿瘤相关类sm原癌基因）有

12、关，特别是与肿瘤的恶性表现联系紧密。腺病毒转导CaSm至胰腺肿瘤后，在体内外能抑制肿瘤细胞生长27。 三、结语综上所述有关胰腺癌基因学方面的研究进展很快, 虽然目前尚未发现特异表达于胰腺癌组织的基因，但利用分子生物学技术检测这些基因改变,有希望成为一种新的早期诊断方法。胰腺癌的基因治疗取得了可喜的进展。尽管目前采用的任何一种基因治疗措施都不尽完善,还存在许多问题,肿瘤的基因治疗已经显示了良好的发展前景,经过研究者们的不懈努力,通过基因治疗治愈胰腺癌有望成为本世纪新的有效治疗手段。参考文献1. Parker SL, Tong T, Bolden S, et al. Cancerstatistic

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