选修3.1.1DNA重组技术的基本工具(上课用)

1、 能否培养出具有抗虫能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？性状的抗虫棉呢？基因工程基因工程：指按照人们的愿望指按照人们的愿望,进行严格的设进行严格的设计并通过计并通过体外体外DNA重组重组和和转基因转基因等技术，赋予等技术，赋予生物以新的遗传特性生物以新的遗传特性,创造创造出更出更符合人们需要符合人们需要的的新的新的生物类型生物类型和和生物产品生物产品。由于基因工程是在。由于基因工程是在DNA分子水平分子水平上进行设计和施工的，因此又叫上进行设计和施工的，因此又叫作作DNA重组技术或基因拼接技术。重组技术或基因拼接技术。基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基

2、本过程基本过程结果结果原理原理优点优点基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平创造出人类需要的新的生物类型和生物创造出人类需要的新的生物类型和生物产品产品剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组定向改造生物性状定向改造生物性状思考：从结构上分析，为什么不同生物的思考：从结构上分析，为什么不同生物的DNA 能够重组？能够重组？基本组成单位相同；空间结构相同；碱基互补配对方式相同基本组成单位相同；空间结构相同；碱基互补配对方式相同DNA DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具本节知识内容本节知识内容 1-1 D

3、NA1-1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具专题一专题一 基因工程基因工程“分子手术刀分子手术刀” 限制酶限制酶 “分子缝合针分子缝合针” DNADNA连接酶连接酶 “分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 识别双链识别双链DNA DNA 分子的某种特定的核苷酸分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是原核生物主要是原核生物40004000种。种。 1、来源：、来源： 2、种类：、种类：3、作用：、作用：5、结果：、结果：形成两种末端形成两种

4、末端黏性末端黏性末端平末端平末端4 4、切割方式：、切割方式：错切和平切错切和平切作用特点：识别特定核苷酸序列，切割特定位点。具有专一性黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端限制性内切酶作用过程 1 1、大肠杆菌的一种限制酶大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)EcoR)能识别能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开形成之间切开形成黏性黏性末端。末端。 2 2、SmaSma能识别能识别CCCGGGCCCGGG序列，序列，并在并在C C和和G G之间切割形成之间切割形成平平末端末端 。常见的两种限制酶中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC

5、序列，并在G和A之间切开。EcoRI限制酶的作用黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaI限制酶的作用在G与C之间切割SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。18仔细观察各限制酶仔细观察各限制酶 识别的特定序列有识别的特定序列有何何 特点？特点？限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是呈现碱基互补对

6、称，无论是6个个碱基还是碱基还是4个碱基，都可以找到个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的一条中心轴线，中轴线两侧的双链双链DNA上的碱基是上的碱基是反向对称反向对称重复重复排列的排列的 ，称为，称为回文序列回文序列想一想想一想1 1限制性核酸内切酶的作用特点体现了酶的哪限制性核酸内切酶的作用特点体现了酶的哪种特性？种特性？【提示提示】限制性核酸内切酶只能识别特定的核限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列，并且只能在特定部位切割，这说明了苷酸序列，并且只能在特定部位切割，这说明了酶具有专一性。酶具有专一性。2.2.限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与DNADNA解旋酶的不同？解旋酶的不

7、同？两者作用部位不同，前者作用于磷酸与脱氧核糖之间的磷酸两者作用部位不同，前者作用于磷酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键，而后者作用于两个碱基之间的氢键。二酯键，而后者作用于两个碱基之间的氢键。3. .原核生物体内限制酶的作用原核生物体内限制酶的作用？限制酶不切割自身限制酶不切割自身DNA的原因是的原因是？切割侵入的外源切割侵入的外源DNA，使之失效，从而达到保护自身的目的，使之失效，从而达到保护自身的目的原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰 学案例学案例1基因的针线：基因的针线：DNADNA连接酶连接酶G A A T T CC T T

8、 A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶切割用同种限制酶切割把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键DNA连接酶的作用DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”1.1.种类种类大肠杆菌大肠杆菌黏性黏性T4噬菌体噬菌体平平2.作用：将切下的作用：将切下的DNA片段片段“缝合缝合”，恢复被限制，恢复被限制酶切开的酶切开的_，拼接成新的，拼接成新的DNA分子。分子。磷酸二酯键磷酸二酯键阅读

9、课本第阅读课本第5页页“分子缝合针分子缝合针”DNA连接酶连接酶的相关内容，的相关内容，完成下列问题完成下列问题两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，注意：注意：DNADNA连接酶可连接双链连接酶可连接双链DNADNA中的中的DNADNA单链缺口，单链缺口，但不能连接单链但不能连接单链DNADNA！DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNA连接酶的缝合作用DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶的比较聚合酶的比较DNA连接酶

10、DNA聚合酶相相同同点点化学本质化学本质都是催化两个脱氧核苷酸之间形成都是催化两个脱氧核苷酸之间形成 键键作用实质作用实质不不同同点点是否需要是否需要模板模板 链 链连接连接DNA单单/双链双链在 之间形成磷酸二酯键将 通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链作用过程作用过程将两个DNA片段连接成重组DNA分子合成DNA分子的一条链作用结果作用结果用途用途基因工程基因工程DNA复制复制磷酸二酯磷酸二酯不需要不需要需要需要双双单单两个两个DNA片段片段单个脱氧核苷酸单个脱氧核苷酸都是蛋白质都是蛋白质A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合

11、酶DNA聚合酶的作用返回DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象 作用结果作用结果用途用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要形成重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键【探规寻律】【探规寻律】几种酶的作用部位几种酶的作用部位限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、连接酶、DNA聚合酶作用于聚合酶作用于部位部位,DNA解旋酶解旋酶作用于作用于部位。部位。学案例学案例2三、分

12、子运输车三、分子运输车基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！内去！能将外源基因送入受体细胞的工具能将外源基因送入受体细胞的工具就是就是载体载体。基因工程的载体被喻为基因工程的载体被喻为：分子运输车分子运输车载体的作用载体的作用载体的必载体的必要条件要条件载体的种类载体的种类阅读课本第阅读课本第6页页“分子运输车分子运输车”运载体运载体的的相关内容，填写下表相关内容，填写下表自主学习细菌的质粒细菌的质粒病毒：

13、病毒：、动植物病毒等。、动植物病毒等。 有标记基因的存有标记基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培养基鉴别。素的培养基鉴别。有切割位点有切割位点能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制质粒质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，之外，并具有并具有自我复制能力自我复制能力的很小的双链环状的很小的双链环状DNA分子。分子。最常用运载体质粒 实际上实际上在基因在基因工程操作中，工程操作中，真正被用作载真正被用作载体的质粒，都体的质粒，都是在天然质粒是在天然质粒的基础上进行的基础上进行过人工改造的。过人工改造的。作为载体的必要

14、条件作为载体的必要条件1. 1.能在受体细胞中复制并稳定保存能在受体细胞中复制并稳定保存2.2.有一个至多个限制酶切位点，供外源有一个至多个限制酶切位点，供外源DNADNA片片段插入段插入3.3.具有标记基因，供重组具有标记基因，供重组DNADNA的鉴定和选择的鉴定和选择4.4.对受体细胞无害对受体细胞无害特别提醒特别提醒主动运输中载体的化学本质是蛋白质，主动运输中载体的化学本质是蛋白质，其作用是运输离子、氨基酸、核苷酸等物质进出细其作用是运输离子、氨基酸、核苷酸等物质进出细胞。胞。基因工程中的载体的化学本质是基因工程中的载体的化学本质是DNA，其作用是，其作用是携带目的基因进入受体细胞。携带

15、目的基因进入受体细胞。思考：天然的质粒思考：天然的质粒DNA分子可以直接用作基因工程分子可以直接用作基因工程的载体吗？的载体吗？实际上自然存在的质粒并不完全具备载体需要满实际上自然存在的质粒并不完全具备载体需要满足的条件，都要进行人工改造后才能用于基因工足的条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。程操作。学案例学案例3限制性内切酶限制性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GGATCC，限制，限制性内切酶性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATC。在质粒上有。在质粒上有酶酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。的切点。（1）请画

16、出质粒被限制酶）请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶）请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性切割后所形成的黏性末端。末端。（3）在）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？成的黏性末端能否连接？为什么？可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）性末端是相同的（或是可以互补的） 小试身手小试身手【易错警示】巧辨基因工程操作工具的【易错警示】巧辨基因工程操作工具的8个易错点个易

17、错点(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。同的黏性末端。(4)将一个基因从将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。个黏性末端。(5)不同不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同分子用

18、同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。便于进行检测。(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8)基因工程中有基因工程中有3种工具，但工具酶只有种工具，但工具酶只有2种。种。【课堂检测】【课堂检测】1-5：CBCBA:6-8：BCB 9、作用底物作用底物作用部位作用部位形成产物形成产物限制酶限制酶DNADNA分子分子磷酸二酯键磷酸二酯键 黏性末端或平末端黏性末端或平末端DNADNA连接连接酶酶DNADNA分子片段分子片段磷酸二酯键磷酸二酯键重组重组DNA分子分子DNADNA聚合聚合酶酶脱氧核苷酸脱氧核苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键新的新的DNA分子分子解旋酶解旋酶DNADNA分子分子氢键氢键单链单链DNADNADNA酶酶DNADNA分子分子磷酸二酯键磷酸二酯键脱氧核苷酸脱氧核苷酸10