环境微生物群落分析的T_RFLP技术及其优化措施

1、应用与环境生物学报2006,12(6:861868Ch i n J App lE n vi ron B i o l=ISSN10062687X2006212225环境微生物群落分析的T2RFLP技术及其优化措施*余素林吴晓磊*钱易(清华大学环境科学与工程系/环境模拟与污染控制国家重点联合实验室北京100084关键词微生物群落;末端限制性片段长度多态性分析(T2RFLP;分子微生物生态学;生物多样性CLC X172App lication and O p ti m ization of T2R FLP M ethod forM icrob i a l C o mm un ity Ana l ys

2、is*YU Suli n,WU X i a ole i*&Q I A N Y i(S t a t eK e y J oi n t Labora tory of E nvironm ent Si mu l a tion and P oll u tion Control,De part men t of E nvironm e n t Science and Eng i n ee ring,T s inghua Un i versit y,Beiji ng100084,Ch i n aAbstr a ct Te r m i na l restricti on frag m ent l en

3、gth pol y morph is m(T2RFLPanalysis is a cultur i ng2independent approach for ana l yzing m icrobia l co mmunity i n envi ron m ents.It has been pro ved to be po werful and wide l y app lied si nce deve l oped i n1997. The pri nc i p l e and genera l procedure of the T2R FLP techn i que for the ana

4、l ysis ofm icrob i a l co mm un ity are discussed i n deta i,l i ncl uding D NA extracti on of enviro n m enta l samp l es,a m plifi cati on of genes encodi ng the16S rRNA,18S rRN A or enzy m esw it h fl uorescen tly labeled pr i m ers,t he restrictio n enzy m e d i gesti on of PCR pro ducts,cap ill

5、ary electrophores i s and the analysis of T2 RFLP profil e.A brief revie w i s a lsom ade o n the research ofm icrob i a l co mmunityw ith the T2R FLP technique i n recent8yea rs.A s with othe r PCR2based molecu l a r techn i ques,the T2RFLP is not free of pitfalls.The li m i ts of t he T2RFLP appro

6、ach are also su mm ar ized as well as the ir possi b le sol uti ons i n this paper.In add ition,so m e va l uab l e web reso urces are introduced for a bet2 ter understandi ng and hand ling of T2RFLP m ethod.W i th the advantages of hi gh sensiti vity,si m pli c ity for auto m atizati on and a2 vail

7、 ability to share t he substantive data o n In ternet,t he T2RFLP is no wadays one of the most po werf u l to ols f or ana lyzi ngm i cro2 b i a l co mmun ity.F i g2,Tab1,R ef62K eyword s m icrob i a l co mm un it y ana l ysis;T2RFLP;molecu l ar m icro b i a l ecology;m i cro b ial diversityCLC X172

8、环境中的微生物都不是单独存在的,总是通过各种信号转递、对空间和营养的相互竞争和依赖等作用而形成微生物群落.分析微生物的群落结构,了解微生物与环境的相互作用关系,有助于从种群和群落水平上深入理解环境中的微生物过程和微生物群落的进化和演替,了解环境污染物迁移转化的微生物学基础,更深刻地认识各种生物处理工艺的微观机理,从而为调控和优化微生物群落、提高处理效果、研究开发新型高效的环境生物修复工艺和处理技术提供理论指导.收稿日期:2005206223接受日期:2005208202传统的微生物群落分析方法建立在微生物分离、纯种培养的基础上,通过对纯种微生物进行显微观察和生理生化特性研究来认识群落结构.由于

9、环境中微生物群落结构非常复杂,物种多样性极高,纯种分离富集培养的方法不但费时费力,而且存在致命的方法学上的缺陷:¹自然界大量微生物的不可培养性,使人类无法培养自然界中所有的微生物1,2;º分离富集培养方法具有强烈的选择性,使培养得到的微生物在种类、数量和功能上都无法反映自然状态下微生物群落的真实情况3.所以,很有必要研究不依赖微生物培养来进行环境微生物群落分析的方法.随着分子生物学技术的发展,自从1986年Pace等人利用核酸序列分析技术研究微生物的生态和进化以来,分子生物学技术已被广泛地应用于微生物群落结构分析,研究方法也层出不穷,包括:聚合酶链式反应(poly m er

10、ase chain reac tio n,PCR4,5、基因克隆文库分析法(gene c l oning library,GCL6,7、荧光原位杂交法(fl uorescence in sit u hybri d izati on ,F IS H 811、限制性酶切片段长度多态性分析法(restr i c ti on frag m en t lengt h poly m orph i s m,RFLP 12、变性梯度凝胶电泳法(dena t ur i ng grad i ent ge l e lectro phoresis ,DGGE13和温度梯度凝胶电泳法(t her m a l gradi

11、ent ge l e lectro phoresis ,TGGE 14等等,并且发展了/分子微生物生态学0这门新兴的学科.这些新兴方法和学科有助于突破传统认识方法的制约,为人类较为准确地认识自然界中微生物群落的结构、功能、进化和演替等等提供崭新的视野和强有力的手段.本文介绍的末端限制性酶切片段长度多态性分析(ter m i 2nal restricti on frag m ent length pol y morph i s m,T 2RFLP 就是在PCR 技术和RFLP 技术基础上发展起来的微生物群落分析的最新技术.这种技术克服了基于培养的传统方法的局限性,相对于其它分子生物学分析技术如R

12、FLP 、DGGE 或T GGE 等,它具有分辨率高、易于实现自动化等特点,还可以将微生物群落分析同核糖体数据库计划(r i boso m a l database project ,RDP 相结合,充分利用互联网海量数据资源共享的优势.1997年以来的大量研究实践表明,T 2RFLP 技术是分析复杂环境微生物群落的最强有力的工具之一1520.1 T 2RFLP 技术的基本原理T 2R FLP 技术以分子系统学的原理为基础,综合运用了PCR 技术、DNA 限制性酶切技术、荧光标记技术和D NA 序列自动分析技术,在DNA 水平上通过对特定核酸片段长度多态性的测定来分析比较微生物群落结构和功能.

13、用T 2RFLP 技术分析微生物群落,首先根据比较基因组学的原理选取一段具有系统进化标记特征的DN A 序列作为目标分析序列.从原理上讲,微生物群落中任何具有特异性的D NA 片段都可以作为目标分析序列,包括微生物核糖体小亚基(SS U 16S rRNA (原核生物和18S r RN A (真核生物的基因序列(即16S r DNA 和18S r DNA21;产甲烷古菌的编码甲基辅酶M 还原酶(m ethyl coenzy m e 2M reductase ,MCR 的mcr A 基因序列、编码氨单加氧酶(a mm onia m onooxygenase ,A MO 的amo A 基因序列、编码

14、反硝化细菌特有的氧化亚氮还原酶(n i 2tro us oxide reductasenos Z 基因序列等等.由于微生物16S r D 2NA 和18S rD NA 在系统分类学和进化研究中的特殊地位22,16S rD NA 和18S r DN A 是最常用的微生物群落结构分析的系统进化标记分子,但是微生物功能基因的特异性保守序列也日益得到重视和被广泛采用.利用T 2RFLP 分析微生物群落时,首先根据微生物群落的特点以及分析目的确定目标DNA 片段,根据目标基因序列上的保守区域设计一对合适的引物,其中一个引物的5c 端用荧光物质标记.采集样品,提取样品中微生物群落的总D NA ,以总D N

15、A 为模板进行PCR 反应,扩增得到各种微生物目标D NA 片段的一端就带有荧光标记.利用合适的限制性内切酶对PCR 扩增的D NA 片段进行消化,不同微生物目标D NA 片段因其核苷酸序列不同会导致酶切位点存在差异,于是酶切后产生许多长度不同的限制性片段.利用D NA 测序仪对酶切产物进行电泳分离和荧光检测,只有末端带荧光标记的片段(ter m ina l re 2stricti on frag m ent ,T 2RF 或者称为操作分类单元(operatio na l taxo no m ic unit ,OT U 才会被检测到,而其他没有带荧光标记的片段则不被检测.由于核苷酸序列具有多态

16、性,也就是说不同微生物的同一个基因的核苷酸序列存在差异,所以同一个基因的D NA 片段在相同的酶切后可能得到长度不同的T 2RF ,反映在T 2RFLP 检测中就是不同的荧光信号.通过对这些荧光信号以及由此生成的T 2RFLP 图谱的分析,就可以揭示样品中微生物的种类、数量和种群大小等,从而解析微生物群落的结构、功能及其动态变化.2 T 2RFLP 技术分析微生物群落的步骤T 2RFLP 技术分析微生物群落的整个流程可以用图1表示,以下对每一操作步骤进行较为详细的介绍 .图1 T 2RFLP 法分析微生物群落结构流程图F i g .1 Procedu re ofT 2RFLP m et hod

17、 t o anal yze m icrob i al co m m un i ty2.1 环境样品的采集、预处理和群落总DN A 的提取T 2R FLP 技术分析的微生物群落可以来自土壤2,6,7,15、水体51、河流底泥8,37或各种人工构建的生物处理工艺14,44,45.不同的采样和预处理方法对DNA 提取、扩增和分析都会产生重大影响23,24,所以要根据不同的环境样品和分析目的来制定相应的采样方案和运输保存方法,防止在样品采862 应用与环境生物学报 Ch i n J App lE n vi ron B i o l 12卷集和运输过程中因溶菌作用造成核酸损失.采集的环境样品可用冰块冷冻保

18、存尽快送回实验室进行分析、保藏或其它预处理;也可用其他方式处理,例如Conrad课题组研究稻田土壤中产甲烷古菌群落,在意大利采集稻田土壤,1d内室温下运送到德国,干燥后在4e和室温下进行保存62.环境样品总DN A的提取是T2RFLP技术的关键之一. DNA提取法应尽可能地提取样品中所有微生物的完整的D NA 分子,使之能够代表样品中的遗传多样性的实际情况.关于群落总D NA的提取方法已经有很多研究和报道,不同方法具有各自的背景和特点2530.由于实际操作中很难保证对所有微生物的完整DNA分子进行提取,所以必须根据T2RFLP分析的目的来选取DNA提取方法.例如,解析微生物群落结构的T2 R

19、FLP分析,D NA提取法就应该将提高D NA提取效率作为重点,充分考虑对种群比较小、细胞难以破碎的微生物DN A的提取,尽可能提取最多种类的微生物DN A;如果重点要研究微生物群落中占优势的微生物种群大小以及功能,则应该着重考虑DNA分子的完整性.总之应根据研究目的和具体样品等实际情况,对微生物群落总DNA的提取方法进行实验优化,找出最适宜的D NA提取方法,保证后续的T2RFLP的准确性.要根据所研究的微生物菌群的具体情况设计引物.对于细菌或古菌,根据其16S rD NA上的某些保守区域来设计通用型引物,可以用来扩增环境样品中大部分真细菌和古菌.对于真核微生物,相应的分类进化分子标记是18

20、S rD NA,同样可以设计出扩增群落中大部分真菌的通用引物.同理,通过对某个纲、某个科或某个目内16S r DNA序列的认识,可以针对性地设计出待扩增群落中所感兴趣的纲、科或目内的微生物的特异性引物.另外,根据编码一些蛋白质氨基酸残基的D NA序列具有高度保守特异性,也可以设计PCR的引物,这些功能基因包括m cr A,p m o A,am o A,nos Z等.具体操作上,对于复杂的微生物群落,选择不同引物扩增得到的目标序列的回收率可能会有差异23,从而影响最终对群落结构的解析.为了尽可能降低因引物效率和特异性差异带来的影响,在引物设计时应使用相应的计算机算法,譬如利用RDP数据库中的探针

21、校验(check pro be,ARB软件包中的探针匹配(probe m atch中来进行分析31.设计出合适的引物以后,通常用荧光物质标记其5c端,以保证PCR反应和后续分析的准确性32.T2R FLP分析技术中的PCR扩增反应是整个分析的关键步骤之一.只有对环境样品中的各种微生物的目的D NA片段进行无差异的高效扩增,才能保证扩增产物的多态性可以真实地反映样品中的微生物DNA多态性.PCR有很多种,包括降落PCR(to uch2do wn PCR,嵌套式PCR等等,不同PCR反应适用于不同情况.影响PCR扩增反应的因素很多,包括模板DNA的浓度、退火温度、反应循环次数、PCR反应体系的组成

22、(例如盐离子浓度、反应体积的大小,Taq酶的种类和浓度以及PCR反应程序的设定等等24,32,要通过各种优化来确定最适宜的反应体系和反应条件.对PCR扩增得到的D NA片段进行纯化,除去残留的带荧光标记的引物,以防止它们对后续分析和检测造成干扰.通常选用识别4个碱基识别位点的合适浓度的内切酶加到一定量纯化后的PCR扩增产物中,在该酶最适的反应体系和温度下进行限制性酶切反应.合适酶量、反应时间的确定都是要保证酶切反应完全,以避免因酶切不完全干扰对群落结构的分析.酶切后的反应混合物要通过热变性使内切酶失活,所得到的酶切后的D NA片段与具荧光标记的标准D NA参照物混合后,利用DNA测序仪进行电泳

23、分离,并且进行荧光和荧光强度的检测.末端限制性片段所带有的荧光标记将被测序仪检测出,其他不带荧光标记的DNA片段则不被检测而不出现在T2 R FLP图谱中,这个过程在有些场合被称为/基因扫描(gene scan0.根据各个T2RF的电泳时间与标准DNA参照物进行比较来计算T2RF的片段大小.随着分析手段的进步,目前D NA 自动测序仪采用的毛细管电泳比传统的平板电泳具有更高的D NA片段分辨能力,对大小为60640bp的限制性片段的检测灵敏度可达1.25bp35,DNA测序仪的自动检测和分析保证了T2RFLP技术分析复杂微生物群落具有分辨率高、易于实现自动化的优势.通过D NA自动测序仪对DN

24、 A片段的基因扫描,利用计算机软件分析得到T2RFLP图谱(图2.通过电泳分离、荧光检测和数据处理得到的T2RFLP图谱上包含有很多微生物群落的信息.图谱分析时,首先要确定DNA片段长度处于一个合适范围(如94827bp,60640bp33,39,或201632bp40,并且荧光强度超过一定阈值(如50RFU19或100RFU32的/峰0才被作为一个有效峰纳入后续的数据处理.不同的荧光检测阈值会导致微生物群落结构和多样性分析结果的差异;提高检测阈值,可使平行样品T2R FLP图谱中的不可重复峰大为减少,但同时也会使一些可重复峰消失,造成对群落多样性的低估16.为了尽可能使结果准确,Dunbar

25、等16建议尽可能降低检测阈值,通过平行实验,将那些在平行实验的图谱中重复再现的峰纳入统计分析.8636期余素林等:环境微生物群落分析的T2RFLP技术及其优化措施图2某石油污染土壤样品中细菌群落的T2RFLP图谱F i g.2T2RFLP profile of an archaeal co m m un it y fro m oil-con ta m i nated soil s a m p l e带有荧光标记物质的T2R F被D NA测序仪中的荧光检测坐标代表了T2RF的片段长度,是根据该T2RF与标准样品中长度已知的D NA片段在电泳中的位置进行比较后计算得到的;峰对应的纵坐标代表含有荧光

26、物质T2RF的荧光强度;峰面积代表了具有相同片段长度所有T2RF的荧光强度的总和.每一个峰可以作为一个OT U来进行分析,那么T2RFLP图谱中就可以包含以下信息:略认为每个峰对应着一个不同的物种.º多样性指数:描述群落多样性的指数有很多,如通过以上T2RFLP图谱,可以计算Shanno n-W e i ner指数:H=-r piln pi 或S i m pson指数:D=1-r p2i其中,pi表示某个峰的峰高占总峰高的比例.»物种均度(evenness:E=H Hm ax其中,Hm ax=ln S对于实验得到的多个群落的T2RFLP图谱,可以分别计算上面的这些指标,进行

27、群落间的比较分析,也可以构造每个群落在一定意义下的距离矩阵,通过计算群落相似度对不同群落图谱进行定量比较39.环境微生物群落通常都非常复杂,具有很高的多样性,表现在T2RFLP图谱上就是具有数量相当多的显著峰,一般用人工或简单直观的方法来进行数据解析比较群落极为困难.因此,T2RFLP图谱的准确分析要利用一些统计学方法或生物数学中的许多专门算法,这些算法包括:冗余分析(redundancy a2 nalysis、聚类分析(cluste r Ana l ysis42、自组织神经网络分析法(self2organizi ng m ap neura l net works,S O M s、主成分分析法

28、(pri nc i pal co m ponent ana l ysis,PCA43等等,而具体的运算可以用一些专门的商业软件来完成.事实上,当前利用T2RFLP 技术进行复杂群落研究的一个最新领域就集中在图谱的分析和数据处理42,目的是使T2RFLP技术成为微生物群落研究的最强有力的工具之一.在T2RFLP图谱分析中一个很重要的方面是了解每个峰是否代表一种微生物,或者具体代表哪些微生物,只有具体了解每个峰所对应的微生物种类才能给出准确和真实的微生物群落结构图谱.尽管在很多情况下,可以粗略认为每个峰对应着一个微生物物种,但是研究表明,不同DN A片段进行限制性酶切有可能得到相同的T2RF,所以

29、为了了解每个T2RF所代表的物种,还需要对T2R F对应的D NA片段的序列进行分析.通常做法是对群落D NA进行克隆、筛选、测序以及分析进化史来了解每个T2RF所代表的物种.3T2RFLP在微生物群落研究中的应用简介近7a来,国外研究者利用T2RFLP技术开展了大量的微生物群落结构方面的研究,表1列举了一些代表性的研究.4T2RFLP分析微生物群落的局限性及其解决方法T2RFLP与其它任何方法一样也有自己的局限性:1T2 R FLP是基于PCR扩增的技术,因此就摆脱不了这类技术共同的缺陷,例如群落中不同菌种DN A的差异性扩增,以及目标D NA在菌种间拷贝数的差异等等58,59,造成分析结果

30、难以准确反映自然群落的多样性以及物种间的相对丰度信息;2该指纹印记技术只检测带荧光标记的末端限制性片段,从理论上讲,T2RFLP图谱中每个T2RF有可能不只对应一个菌种,造成对群落多样性的低估;3酶切后T2RF的长度分布也会造成对复杂群落多样性的低估;因为测序仪检测500bp以上的T2 R F精度不够.对于更长的片段,检测分辨率明显下降60;4实验过程影响因素众多,使得T2RFLP图谱的解析存在一定的不确定性;比如DNA提取方法、PCR中的参数设置及限制性内切酶等的选择都可能直接对最终的T2RFLP图谱产生影响;5如何对大量T2RFLP数据进行处理和统计学分析,以挖掘出其中蕴含的微生物群落结构

31、信息是目前T2RFLP技术研究的焦点之一,很多理论和技术上的问题仍处于摸索和逐步完善阶段,例如,目前对某个群落的T2R FLP图谱构造的距离矩阵来进行复杂群落的比较分析时,通常仍以某个峰的出现与否分别定义为1或0,从而将每张T2RFLP图转化为一张二进制数表39,这种方法没有将相应的峰高数据考虑进去.864应用与环境生物学报Ch i n J App lE n vi ron B i o l12卷表1T2RFLP分析技术在微生物群落研究中的应用Tab le1Applica ti on of T2RFLP ana l ysis in m i crobial co mmunity study序号Num

32、b er 研究内容A i m主要结论M ain concl u sion文献来源Ref eren ceT2RFLP技术用于研究微生物群落的多样性App li cati on of T2RFLP approach f or analyzi ng b i od ivers i ty ofm icrob ial co mm unity1分析市政污水厂好氧生物处理池污泥等4种样品中的微生物群落多样性To i nvestigate t h e b i odivers it y ofm icro2b ial co mm un ity i n aerob ic acti vated s l udge fro

33、 m m un i ci palwaste water treat m en t p lantT2RFLP技术是分析微生物群落多样性的可靠有力的工具T2RFLP app roach is powerf u l and reliab l e for an al yzi ngb i od i vers it y ofm icrob i al co m m un i ty412研究了处理生活污水的强化生物除磷工艺(EBPR工艺中活性污泥微生物群落结构Study on activatedsl udge m icrob i al co mmun it y i n enhanced b i ologica

34、l phos2phorus re m oval(EBPRp rocess两种运行方式下活性污泥中的微生物群落结构有明显差异,而用FIS H技术却未发现差异Detected by T2RFLP,s tructure ofm icrob ial co m m un it y i s re m arkab l y dif2ferent i n t w o d ifferen t runn i ng processes,wh il e F I S H cannotreveal t h e difference443分析美国西南部4种不同性质的土壤中的微生物群落To anal yze m i crob

35、ial co m m un i ty fro m4d i ff eren t soils i ns outhwestern Am ericaT2RFLP技术能简便快速地分析土壤微生物群落多样性T2RFLP techn i que can reveal b i od i versity of soil m i crob i alco m m un it y easil y394研究一个实验规模的生物反应器的活性污泥中真核微生物群落St udy on eukaryoti c acti vated sl udge m i crob i alco mmun it y in a lab-scal e b

36、 i oreact orT2RFLP要比DGGE分辨率更高,非常适合用于对微生物群落多样性进行快速、灵敏的分析评价T2RFLP has ah i gher sensiti vity t h an DGGE,wh ich m akes T2RFLP mores u itab l e f or m icrob i al co m m un it y anal yses46T2RFLP技术用于研究微生物群落受各种环境因子影响后的时空变化规律App lication of T2RFLP approach f or an al yzi ng spati al te m poral pat2 ter n

37、ofm icrob ial com m un i ty i n fl uenced by any environm en t al factor1在3种性质差异显著的土壤中都加入两种不同的有机肥,用T2RFLP技术考察土壤中真菌群落的动态变化An al yses of fungal com m unity in d iff eren t soils fertiliz ed witht wo k i nd s ofm anu res每种土壤中加入有机肥后,真菌群落都会发生变化;而且某种土壤加入不同的有机肥,其中的真菌群落的变化呈现出不同的特点Fungal co mmun it y changes

38、 i n d ifferen ts o il s and differen tm anure add i ti on s332研究种植不同品种马铃薯的农田土壤中细菌群落结构受到的影响及其变化To study m i crob i al co mmun it y i ns o il s plan t ed w it h d ifferen t k i nd s of potat oesT2RFLP技术用于分析高度多样的土壤细菌群落时,不仅可以揭示群落结构的空间异质性,而且能够揭示群落结构随时间的变化规律T2RFLP approach can reveal t hes pati al and te

39、 m poral change of m icrob i al co m m un i ty stru c2t u re153研究在实验室控制的微宇宙环境下对土壤受铜离子污染后微生物群落发生的动态变化T o st udy the i n fluenceof cupper i on on soil m icrob i al com m un i ty i n a m i crocos mst udy未受铜污染的背景土壤、轻度污染、重度污染土壤的微生物群落结构存在显著的差异Si gn ifi can t d ifference ofm i crob ial co m m un it y s tru

40、ct ure was detected by T2RFLP a2m ong s o il s wit h d ifferent i on conta m i nati ons484分析因施用除草剂4,6-二硝基甲酚对农田土壤中微生物群落的影响Infl uence of DNOC on agricu l tural s o ilm i2crobial com m un i ty每公斤土壤样品中加入50m g DNOC,15d以后,微生物种类大为减少,T2RFLP图谱中仅能检测到23个显著峰M i crob i al s peci es reduced m ark edly after DNOC

41、add iti on49T2RFLP用于研究环境微生物群落中的特殊功能基因App licati on of T2RFLP approach for ana l yzi ng special gen es i n environm ental m icrob i al co mmun it y1以甲烷氧化菌的pm o A基因设计扩增引物,研究稻田土壤中甲烷氧化菌群落的多样性T o st udy b i odivers it y ofm et h anotroph co mmun ity i n paddy s o il by anal yzi ng p m oAgene对于DGGE,T2RFLP

42、分析群落结构具有更高的分辨率T2RFLP has a h i gher sensiti vity than DGGE382扩增群落中的编码氨单加氧酶的a m o A基因序列,研究氨氧化菌群的多样性To study b i od i vers it y of a mm on i a ox2i d izi ng m icrob ial com m un i ty by an al yzi ng a moA gen eT2RFLP技术是一种可靠的手段,可用于快速分析环境样品中氨氧化菌群的群落结构T2RFLP is a reliab l e ap2p roach t o anal yze struct

43、 u re of a m m on ia oxi d izi ng m i crob i alco m m un it y543通过扩增编码反硝化过程中一关键酶的n i rS基因来研究太平洋海底沉积物中反硝化菌群的组成To st udy de2n itrif y i ng bacteri al co mm un ity i n pacific s ed i m en ts by anal y2zi ng n irS gen e扩增得到的n i rS基因序列用H haI、M s p I以及T aqI酶切后分别产生多达173、139和131个T2RFs,说明T2RFLP分析反硝化菌群落的分辨率很高

44、T2RFLP is a s en siti veapproach f or anal yzi ng den itrif yi ng bacteri al co m m un it y,173,139and131n i rS gene T2RFs were det ect ed wh enH haI、M spI and TaqI were app li ed res pecti vel y374根据汞抗性基因m er基因序列设计特异扩增引物,检测和评价该基因在长期受汞污染的土壤和沉积物中的存在情况To d etect and eval uate m er gene i n s o il s an

45、d sed i2m en ts poll u ted with m ercu ry方便高效,还从土壤和沉积物T2RFLP图谱中发现了新的汞抗性基因型New m er gene type was detected by T2RFLP m et hod56为了解决上述局限性,需要根据研究目的、样品、环境条件等对T2RFLP分析的各个步骤进行优化,克服不足,尽可能地使分析结果准确、真实.这些方法包括:对DNA片段进行克隆、测序和分析,了解各个T2RF所代表的所有微生物种类;利用多种酶对PCR扩增产物分别进行酶切,将多个T2RFLP图谱进行综合分析20,以减少因一个T2RF可能对应多个物种造成对865

46、6期余素林等:环境微生物群落分析的T2RFLP技术及其优化措施866 应 用与 环 境生 物学 报 C h in J App l E n viron B io l 12卷 群落多样性低 估的 问题; 利 用毛 细管 电泳 技术, 提 高对 1 000 bp以下 片段的分辨率 60 等等. 总之, 尽管 T2RFLP 技术存在不 少的缺陷, 但 是, 在 复杂微 生物群落的研究中, 该技术仍然具有其它许多分子生物学技术 所 不 具 备 的 优 越 性. 大 量 的 研 究 表 明, 与 DGGE / TGGE 2, 15, 38, 40, 46 或 RFLP /ARDRA 61相比, T2R F

47、LP 技术分析 复杂的微生物群落结 构具有更高的分辨率, 更适合于对微生物 群落多样性进行灵敏的 分析评 价, 以及快 速地研究、 析微生 分 物群落的变化规律. of 5c- nuclease PCR for qu ant itat ive detect ion of listeria m onocytogenes in pure cu ltures water sk i m ilk and unpas teu rized who lem ilk. App l , , m , & Environ M icrobiol, 2000 66 ( 10 : 4266 4271 , 5 Voy

48、tek MA, W ard BB D etect ion of ammoniu . m2ox id izing bacteria of the beta2sub class of th e class P roteobacteria in aquat ic samp les w ith the PCR. App l& Environ M icrobiol, 1995 61 ( 4 : 1444 1450 , 6 Dunbar J Tak ala S Barns S. M, Davis JA Ku ske CR. Levels of bac2 , , , terial co mmun i

49、ty d ivers ity in f r arid soils co ou mpared by cu ltivation and 16S r RNA gene clon ing App l & Environ M icrobiol, 1999, 65 ( 4 : . 1662 1669 7 R ondon MR, August PR, B etter ann AD, B rady SF, G rossm an TH, m L iles MR, Loiacono KA Lynch BA M acn eil I M inor C, T iong CL , , A, , G il an M

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