壳聚糖交联特性对壳聚糖βTCP微球成球性的影响_图文

1、 塑型!笪童竺量!塞墨塑奎壁堡堡翌塞墨矍,竺匹!垡鲨堕壁丝塑墅堕:堑:80,在500“min的速度下搅拌1h进行乳化;然后再加入6mI的戊_=醛溶液(25%,搅拌30min使其分散均匀,置于50水浴锅中进行交联,10h后取出进行过滤,用氯仿洗涤3次后再用乙醇抽提10h,最后在烘箱中进行干燥后获得壳聚糖/卢TcP复合微球。2.3性能测试与表征,本研究采用McR300型高级扩展流变仪对壳聚糖溶液的静态流变学和交联过程的动态流变学进行了测试。其中,静态流变学在圆筒模式下进行,测试了壳聚糖溶液的粘度随剪切速率的变化规律,测试在室温下进行:交联过程中复粘度测试采用平板模式,并固定角速度(10rad/s和

2、应变(100%,对加入l%戊二醛溶液的壳聚糖溶液的储能模量(G和耗能模量(G”随时间的变化规律进行测量,同时得到壳聚糖溶液的凝胶点。微球形貌采用扫描电子显微镜(HitachiS.450进行观察。3结果与讨论31微球的形貌微球的形貌和表面结构是微球作为微支架材料最为重要的特点,为解决壳聚糖/庐TcP复合微球成球过程中容易发生破碎的问题,本研究引入了初交联工艺,即在壳聚糖/肛TcP溶液进行乳化前在其中加入一定量的交联剂,一方面可以略微提高溶液的粘度,更为重要的是提高了交联剂在微球内部的分散均匀性,这样就可以有效提高微球的交联强度,保持微球的球形形貌。初交联工艺中交联剂戊二醛溶液的浓度、加入量、搅拌

3、时间等参数会对最终获得的微球的形貌产生显著的影响。图1为不同初交联工艺下所获得微球的形貌。 图l不同初交联工艺(戊二醛溶液浓度×加入量×搅拌时蚓下所制各的壳聚糖,卢TcP复台微球形貌sEM photograpl塔ofchitosaD,卢TcP composite microspbc坤8prcpared bydi触tprcparatory cross-linking proced毗e:扣o;(b0.25%×3m扯10min,(c0.5%×3mlx6mill;(dO 5%×3ml×lOmin(e0.5%×3mlxl2min;(D

4、1%×3mlx6min由图l可以看到,未采用初交联工艺的微球大部分发生了破裂(图1a;当交联剂加入量过少(图lb时,制得的微球中破裂的量有所减少,但仍不可忽略;而当戊二醛加入量适当(图lp图1e或过多(图】f时,所得微球基本上没有破裂。表明初交联工艺的引入可以有效提高微球的交联强度,并有利于保持微球的外形。由于添加了交联剂后,戊二醛将与壳聚糖分子发生反应,会引起溶液粘度的增加,因此初交联的时间对于微球的形貌会起到重要的作用,如图l所示,加入量均为O.5%x3ml,当初交联时间仅为6min时。获得长条形的“微球”;当初交联时间为10min时,获得微球球形良好,且球径适宜(150450“

5、m;而当初交联时间延长到12min时,获得球径过大(>450啪的球。引起这些变化的原因可能与乳化时溶液的粘度及其流变学性质不同有关。壳聚糖/肛TcP复合溶液加入戊二醛后粘度的变化主要由壳聚糖与戊二醛的交联反应引起,因此为分析简 壳聚糖交联特性对壳聚糖/-TCP微球成球性的影响作者:昝青峰, 成鹏, 李兆新, 王晨, 董利民, 田杰谟, Zan Qingfeng, Cheng Peng, Li Zhaoxin, Wang Chen, Dong Li-min, Tian Jiemo作者单位:清华大学新型陶瓷与精细工艺国家重点实验室,清华大学核能与新能源技术研究院精细陶瓷室,北京,100084

6、刊名: 稀有金属材料与工程英文刊名:RARE METAL MATERIALS AND ENGINEERING年,卷(期:2007,36(z2被引用次数:1次参考文献(3条1.Qiu Q.Ducheyne P.Ayyaswamy P查看详情 20002.Merkovich E A.Carruette M L.Babak V G查看详情 2001(033.Vogelsberger W.Seidil A.Fuchs R查看详情 2000相似文献(10条医学研究2010,26(4目的:研究经壳聚糖(Chitosan,CS修饰的羟基磷灰石-磷酸三钙(hydroxyapatite-tricalcium,H

7、ATCP复合材料修复犬牙槽骨缺损.方法:制备CS溶液修饰HA-TCP.以CS修饰的HA-TCP复合材料修复犬牙槽骨缺损,选取3只成年犬876 -| 678作为受试牙,在受试牙根分歧处制备长宽高均为5 mm的箱型骨缺损,分成两组,左侧作为实验组:将CS修饰的HA-TCP复合材料植入犬牙槽骨缺损部位;右侧作为对照组:将HATCP植入犬牙槽骨缺损部位;植入8周后将实验动物处死,组织学观察并图像分析新生骨组织的形成状态.结果:实验组新生骨组织占缺损的百分比明显高于对照组,有统计学意义(P<0.01;实验组剩余材料占缺损的百分比小于对照组,有统计学意义(P<0.01.结论:CS修饰后的HA-

8、TCP复合材料修复犬牙槽骨缺损效果优于单纯HA-TCP修复牙槽骨缺损.2.期刊论文赵清桐.赖仁发.汪距.李红.Zhao Qing-tong.Lai Ren-fa.Wang Ju.Li Hong壳聚糖/-磷酸三钙/重组人骨形态发生蛋白2可注射性复合体修复兔下颌骨缺损-中国组织工程研究与临床康复2009,13(51背景:传统固态组织工程骨不能满足口腔颌面外科不规则骨缺损的修复,液态细胞和生长因子难以在其中达到均匀分布.随着微创伤外科技术的发展,研制和应用可注射性骨替代材料已成为一个重要的努力方向.目的:观察壳聚糖/-磷酸三钙/重组人骨形态发生蛋白2(chitosan/beta-tricalcium

9、 phosphate/recombinant human bone morphogenetic protein-2, CS/-TCP/rhBMP-2可注射性复合物修复兔下颌骨缺损的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-05/2009-03在暨南大学医学院动物实验室完成.材料:应用液态壳聚糖和固态-磷酸三钙体外混合形成的复合体为支架,加入rhBMP-2冻干粉,制成可注射性人工骨.方法:取24只新西兰大白兔制备双侧下颌骨缺损,随机分为4组:CS/-TCP/rhBMP-2组:将1 mL CS/-TCP/rhBMP-2复合物无针头注射器注入颌骨缺损部.CS/-TCP组:将0.5 mL.

10、CS/-TCP复合物用无针头注射器注入颌骨缺损部.自体骨组:植入髂嵴处的骨质.空白对照组:不植入任何材料.主要观察指标:术后2,4,8周取材后行苏木精-伊红染色、I型胶原免疫组化染色及扫描电镜观察材料降解及新骨生成情况.并应用双能X射线骨密度仪检测骨矿物密度,以探明成骨的质量和成骨速度.结果:CS/-TCP/rhBMP-2组的骨痂量与自体骨组相当,而多于其他组.各时间点CS/-TCP/rhBMP-2组、自体骨组骨基质比CS/-TCP组和空白对照组多.术后8周,CS/-TCP/rhBMP-2组材料与周围骨床形成骨性结合,间隙基本消失;其他实验组间隙也有所减小,材料降解明显,界面处不能看到完整材料

11、结构.术后各组骨缺损区随时间延长密度逐渐增大,CS/-TCP/rhBMP-2组术后2,4,8周骨密度值明显优于CS/-TCP组和空白对照组(P<0.05.结论:CS/-TCP/rhBMP-2复合体具有良好的生物相容性、降解性、骨引导及骨诱导能力.CS/-TCP可作为rhBMP-2良好的注射性载体,有希望成为微创外科修复骨缺损的新型可注射载体材料.2008关节软骨缺损是临床的难题之一,自体关节软骨移植存在来源有限、创伤大、费用高等缺点,异体关节软骨移植难以排除免疫源性的问题。随着组织工程的发展,利用人工再生组织来修复关节软骨缺损,为临床解决这一难题提供了新的思路和方法。虽然关节软骨组织工程

12、的研究已经取得了很大进展,但仍有大量的问题等待解决。尤其是软骨和软骨下骨的分层、断裂问题,和宿主的整合问题,关节软骨修复的长期效果等。目的:将胶原、壳聚糖与-磷酸三钙(TricalciumPhosphate,TCP有机复合,模仿体内关节软骨的分层结构,增加支架材料的力学强度,构建胶原/壳聚糖/-TCP层状梯度支架材料。分别将扩增的经成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞(BoneMesenchymalStemCells,BMSCs和软骨细胞植入其中体外微重力下培养,对照组采用普通培养板培养,观察成骨细胞和软骨细胞在胶原/壳聚糖/-TCP层状梯度修复体中的黏附、增殖及生物学性状变化,以评价该复合材料作为关

13、节软骨组织工程支架的可行性,并观察模拟微重力对细胞及构建组织的效用。方法:以细胞和支架材料为实验对象,以普通培养和微重力培养分两组对照。MTT实验分组:5个时间组:1天、3天、5天、7天、9天。5个平行孔/组,两培养组共50孔。1.成骨细胞和材料复合:用全骨髓贴壁筛选法培养新西兰兔原代BMSCs,体外扩增后进行成骨诱导,3周后检测细胞碱性磷酸酶活性和钙结节生成情况,诱导成功后和修复体复合体外普通培养和旋转培养仪模拟微重力培养,进行MTT检测比较两组细胞增殖情况并观察模拟微重力对细胞的影响;培养1周后行扫描电镜检查观察成骨细胞在修复体材料内黏附生长情况;4周后,细胞和材料复合物脱钙、石蜡包埋、切

14、片,行苏木精-伊红染色及I型胶原免疫组织化学染色,观察成骨细胞的生物学性状变化及模拟微重力对复合物的力学影响。2.软骨细胞和材料复合:取新西兰幼兔的关节软骨消化培养软骨细胞体外培养扩增,取2、3代细胞行s-100细胞免疫化学染色,收集前4代软骨细胞作为种子细胞和修复体复合体外普通培养和旋转培养仪模拟微重力培养,进行MTT检测比较两组细胞增殖情况并观察模拟微重力对软骨细胞的影响;培养7天后行扫描电镜检查观察软骨细胞在修复体材料内黏附生长情况;4周后,细胞和材料复合物进行脱钙、石蜡包埋、切片,行苏木精-伊红染色及II型胶原免疫组织化学染色,观察软骨细胞的生物学性状变化及模拟微重力对复合物的力学影响

15、。统计学分析:MTT实验中,相同时间点两组之间的比较用两独立样本t检验;同组不同时间点比较采用完全随机设计单因素方差分析(One-wayANOVA;两组整体之间比较采用重复测量数据的方差分析。=0.05为统计学检验水准。结果:养液后细胞生长相对缓慢，其形态发生了改变，细胞逐渐增大，进而出现重叠生长。2周后细胞间可见圆形或卵圆形的钙化结节，结节周围细胞呈放射状 分布。碱性磷酸酶染色阳性，VonKossa法检测出钙化结节。体外单层培养的软骨细胞呈球形，悬浮在培养液中,5h后开始贴壁，细胞呈扁平状，大多数三 角形，少量多角形，约1周细胞铺满培养瓶，呈“铺路石”样。第2、3代细胞S-100免疫细胞化学

16、染色胞浆内呈阳性反应。 2.细胞/支架光镜下观察：细胞悬液滴加于经预湿处理的复合支架材料上，支架材料迅速膨胀，证明细胞扩散到支架内。接种24h后，倒置显微镜下 见材料不透明，无法观察其内细胞生长情况，但可见大量成骨细胞或软骨细胞贴附在材料旁培养板内。 3.MTT检测：成骨细胞和材料复合后，除第1天两组之间无显著性差异外(P=0.706，其余时间点两组之间有显著性差异(P<0.05，模拟微重力组明显 比培养板组细胞增殖力高。两组之间整体比较也有统计学意义(P=0.000，证明模拟微重力对成骨细胞在修复体内的增殖比普通培养起到了更好的促进作 用。软骨细胞和材料复合后，不同时间点两组之间有显著

17、性差异(P<0.05，模拟微重力组明显比培养板组细胞增殖力高。两组之间整体比较也有统计学 意义(P=0.000，证明模拟微重力对软骨细胞在修复体内增殖比普通培养起到了更好的促进作用。 4.扫描电镜：培养7d后，细胞成团地吸附于修复体表面及孔隙侧壁，并可见细胞间通过突起相互连接，或伸出伪足贴附于支架孔隙壁上；从复合支 架材料中间切开，普通培养组见其内部有少量细胞贴附于孔隙侧壁，模拟微重力组则可见到大量细胞，细胞数量比普通培养组明显增多。 5.HE染色和免疫组化结果：成骨细胞和材料：4周后，材料表面可见大量细胞，内部可见部分细胞聚集成团；细胞呈长梭形，细胞团中有基质分泌 ，沉积于细胞周围；I

18、型胶原免疫组织化学染色示胞浆内呈阳性反应。软骨细胞和材料：4周后，材料表面可见大量细胞黏附成层状，内部亦可见细胞聚 集成团；细胞呈圆形或椭圆形，细胞团中有基质分泌，沉积于细胞周围，II型胶原免疫组织化学染色示胞浆内呈阳性反应。普通培养组的细胞多聚集在 修复体表面，细胞数量明显多于修复体内部，而模拟微重力组材料表面和材料内部细胞数量相差不大，内部细胞数量明显比普通培养组多。 结论: 1.成功培养出兔原代软骨细胞和BMSCs，并成功诱导BMSCs为成骨细胞，为进一步的细胞和材料的接种提供了数量充足和生物学性能良好的种子细胞 。 2.胶原/壳聚糖/-TCP层状梯度复合体模拟了正常关节软骨分层结构，细

19、胞相容性好，能提供细胞生长的三维环境。 3.转壁式旋转培养仪产生的模拟微重力可以使软骨细胞和成骨细胞在修复体内高密度生长，能更好的促进细胞增殖和细胞外基质分泌，提高了组织 工程化关节软骨体外培养的质量，为关节软骨组织工程的研究开辟了新的道路。 4.期刊论文 管大为.李慕勤.吕忠华.GUAN Da-wei.LI Mu-qin.LU Zhong-hua HA-TCP/壳聚糖多孔生物材料的凝胶注 模研究 -佳木斯大学学报（自然科学版）2007,25(5 采用凝胶注模成形工艺制备了HA-TCP/壳聚糖多孔生物材料,通过改变单体和复合粉体的不同配比,来比较复合材料的综合性能.结果表明:用偶联剂改 性HA

20、-TCP后采用凝胶注模法成型制备HA-TCP/CS多孔生物材料,试样的形状容易控制,可以通过调整凝胶时的单体含量来控制抗压强度,其值约为60MPa左右 ,也可控制孔隙率,其值约为70%左右,孔隙多为微孔直径约在10m. 5.学位论文 曹德勇 -磷酸三钙/壳聚糖-明胶复合骨水泥研究 2003 人体骨是羟基磷灰石(HA纳米晶粒和柔性胶原纤维构成的复合材料.尽管HA具有良好的生物相容性和骨传导性,但在复杂的应力状态下使用寿命不确 定.为提高骨修复材料的仿生程度且改善其力学性能,论文将结构类似于糖胺聚糖(GAGs的壳聚糖(CS和胶原的部分变性衍生物明胶(Gel和-磷酸三钙 (-TCP复合,制备出磷酸钙

21、/CS-Gel网络复合骨水泥材料.这种复合材料模拟了自然骨的无机/有机两相结构.壳聚糖与明胶都是生物活性材料,能促进组 织修复.壳聚糖上具有胺基能与明胶表面的羧基通过静电相互作用形成聚电解质配合物网络.-TCP是骨传导材料,生物相容性好,无细胞毒性,它通过水化 反应逐渐转变成HA.无机相(-磷酸三钙提供材料的抗压缩性,而有机相(壳聚糖+明胶网络使材料具有一定的韧性.此复合材料可望提高材料的生物活性 、改善微观结构以并提高压缩强度,利于骨缺损修复.该文对比研究了-TCP骨水泥及其壳聚糖/明胶的结构和性能的关系,且考察了这两种骨水泥的液相 浓度、液固化、水化反应时间、原料的组分等对骨水泥性能的影响

22、.结果表明此复合骨水泥在骨组织修复有应用前景. 6.期刊论文 张芳.李卫星.ZHANG Fang.LI Wei-xing 壳聚糖-明胶-磷酸三钙多孔复合体负载骨形成蛋白2用于组织 工程骨的构建 -山西医药杂志2007,36(6 目的 探索壳聚糖-明胶-磷酸三钙(CS-Gel/TCP多孔复合体作为骨形成蛋白(BMP-2缓释载体的可行性.方法 采用相分离法制备CS-Gel/TCP支架负载 BMP-2复合体材料;将兔骨髓基质细胞(MSC进行体外培养、扩增、诱导为骨髓基质成骨细胞(MSO,检测CS-Gel/TCP支架负载BMP-2复合体对细胞增殖与分 化的影响.结果 MSC可在CS-Gel/TCP支架

23、上良好生长,其增殖能力不受影响,碱性磷酸酶(ALP活性提高.结论 CS-Gel/TCP多孔支架可以作为BMP-2有效的载 体. 7.学位论文 管大为 壳聚糖为模板制备纳米磷酸钙类多孔生物材料 2008 采用凝胶注模法和真空冷冻干燥法，以偶联剂KH-570和NDZ-311为改性剂制备ILA-TCP/CS多孔生物材料。研究了HA-TCP与CS的比例、单体和复合粉体 的不同配比和偶联剂KH-570和NDZ-311的用量对多孔生物材料微观形貌、机械强度和孔隙率的影响：研究了HA-TCP粒子不同的分散方法；并研究了多孔生 物材料试样在模拟体液中的生物活性。采用SEM、TEM观察粉体和表面形貌，利用XRD

24、进行物相分析，TR进行官能团分析，能谱分析仪进行元素的定量分析 ，并利用对多孔生物材料的TG-DSC曲线的分析，对多孔生物材料性能进行深入的研究。 研究表明，采用凝胶注模法制备的HA、HA-TCP、-TCP三种KH-570改性粉体的复合材料的抗压强度都在20MPa左右，孔隙率在4354之间。其中 HA-TCP的复合材料效果最好，孔隙率为51，抗压强度为20.8MPa。通过优化设计丙烯酰胺单体含量，当单体加入量为1克时材料的抗压强度为 38.5MPa，孔隙率为66，孔的分布比较均匀，孔径大小也比较一致，宏观孔很少，主要是直径为10m左右的微孔。采用真空冷冻干燥法制备的HATCP/CS多孔生物材料

25、当HA-TCP:CS=7:3时，采用双改性法，KH-570和NDZ-311的加入量分别为HA-TCF粉体和CS粉体的1wt时平均抗压强度为11.6MPa，比 未改性前提高了近5倍，二者的孔隙率大致相同为83。研磨-搅拌-超声分散复合方法可在CS模板上获得分散均匀的HA-TCP粒子，多孔生物材料的性能最 佳。偶联剂KH-570和NDZ-311的加入对材料的相结构影响不大，只是材料中各相对应的特征衍射峰的强度略有变化。HA-TCP/CS、1wt-KH-570+HATCP/CS、HA-TCP/1wt-NDZ-311+CS和1wt-KH-570+HA-TCP/1wt-NDZ-311+CS四种材料在SB

26、F浸泡后，表面均可形成含碳酸根的类骨磷灰石，说明四种 材料均具有较好的形成类骨磷灰石的能力。 8.期刊论文 黄鑫.孟国林.刘建.袁志.熊卓.李国臣.白峰.禚文昆.马煜.吕荣.王军.郝赋 骨形态发生蛋白-2壳聚糖 微球复合组织工程支架修复兔股骨髁部骨缺损的实验研究 -中华创伤骨科杂志2010,12(4 目的 探讨重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2壳聚糖缓释微球复合聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙(PLGA/TCP支架修复骨缺损的可行性和有效性.方法 取健康成年新西兰大白兔45只,在40只实验动物股骨髁部制备0.6 cm×1.0 cm骨缺损.实验分4组:A组:缺损组,B组:用PLGA/T

27、CP空白支架修复骨缺损,C组 :用等量rhBMP-2复合PLGA/TCP支架修复骨缺损,D组:用rhBMP-2壳聚糖微球复合PLGA/TCP支架修复骨缺损,每组10只动物.另5只动物为正常对照组(E组.应 用X线、Micro-CT和组织病理学等方法检测术后4、12 周各实验组骨缺损修复效果.结果 术后4周X线片示:A组无新骨形成.B组有少量新生骨影像形成,C、 D组骨缺损部位均有新骨影像形成.术后12周,Micro-CT结果显示:D组骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目等指标均优于B组和C组,差异均有统 计学意义(P<0.05,A组末检测到上述指标.术后4剧,D组可见大量骨组织形成

28、,有部分成熟的骨小梁,PLGA/TCP支架大部分被降解.吸收.术后12周,D组支架 和微球完全降解.骨缺损被成熟骨取代;B、C、D组骨长入率分别为5.78%±1.21%、37.26%±6.45%、74.25%±8.91%,3组之间比较差异均有统计学意义 (P<0.05.结论 复合rhBMP-2壳聚糖微球的PLGA/TCP支架具有良好的骨缺损修复效果,临床应用前景较好. 9.期刊论文 赖仁发.赵清桐.刘湘宁.沈山.LAI Ren-fa.ZHAO Qing-tong.LIU Xiang-ning.SHEN Shan 壳聚糖/-磷 酸三钙支架复合骨形态发生蛋白后成骨效能研究 -华西口腔医学杂志2010,28(5 目的 通过壳聚糖(CS/-磷酸三钙(TCP复合重组人骨形态发生蛋白(rhBMP-2修复兔下颌骨缺损,探索CS/-