定量产色基质鲎试剂检查药品注射剂内毒素的研究(之一)

1、    定量产色基质鲎试剂检查药品 注射剂内毒素的研究(之一)        目前国内主要用凝胶试管法鲎试剂检查药品注射剂的内毒素，属于半定量的限量试验，不易判断内毒素稀释浓度的准确量值。我国2000年版药典将扩大增加应用品种，首先需要对该品种进行内毒素限值（L）与干扰试验等。我们应用定量产色基质鲎试剂检查药品注射剂内毒素量值，采用内毒素各个稀释浓度的标准曲线进行定量研究，现将研究结果介绍如下。 1反应原理鲎血中的多功能白色变形细胞内含有能被细菌内毒素激活的凝固酶原

2、、凝固蛋白原与C因子，B因子等。当细菌内毒素先激活C因子，活化C因子再激活B因子，活化的B因子激活凝固酶原成活化凝固酶水解凝固蛋白原使其形成凝固蛋白，产生凝胶1。依据此酶分子生化反应的机理，用人工合成产色基质鲎三肽（Boc-leu-Gly-Arg-PNA）作为凝固酶反应底物，利用鲎试剂中被细菌内毒素激活的凝固酶水解鲎三肽中的Arg-PNA之间的结合键，使其游离出PNA(对硝基苯胺呈淡黄色23。进一步用偶氮试剂使其偶氮化，形成偶氮兰复合物，呈玫瑰色，于波长545 nm比色读数，其产色深浅与内毒素浓度呈线性关系，从而准确地测定出检品中的内毒素含量4。2实验材料2.1主要器材723型可见分光光度计(

3、上海分析仪器总厂)光度正确度0.5，石英比色杯光通径1.0 cm，旋涡混合器，恒温水浴箱，定量可调移液器50 l、100 l、500 l、10×75 mm试管。2.2主要试剂定量鲎试剂盒(福州东方鲎试剂厂)批号990701，细菌内毒素工作品(福州东方鲎试剂厂)批号990701；150 EU支，细菌内毒素检查用水规格2 ml支(福州东方鲎试剂厂)批号990701供试品等。3实验方法与结果3.1检测步骤0.05 ml定量鲎试剂0.1 ml内毒素工作品稀释液供试品液，于37 30 min后加入0.05 ml鲎三肽再于37 3 min，用0.05 ml NaNO2HCl混匀后加0.5 ml氨

4、基磺酸铵混匀后，再加0.5 ml萘乙二胺于波长545 nm比色读数。3.2使用器材的予处理凡在本检查过程中与鲎试剂液接触的物件、试剂等未被NaNO2HCl终止反应前均需去除热原。玻璃器材，清洗干净后置于250干热4 h；不耐高温和塑料移液吸头等，清洗干净后，再用75乙醇的2N NaOH溶液浸泡过夜，逐个用无热原水冲洗干净后，置60烘箱中烘干备用。3.3标准曲线制订3.3.1 细菌内毒素工作品的稀释：取150 EU安瓿加1.5 ml细菌内毒素检查用水(简称BET)于旋涡混合器上混合15 min，以后每稀释一步均须混合30秒。为100 EUml10 EUml1 EUml0.5 EUml0.25 E

5、Uml0.125 EUml0.06 EUml0.03 EUml。3.3.2取系列稀释的最后4个稀释度(即（0.25、0.125、0.06、0.03 Euml）制订标准曲线，每一稀释度平行设2管，再用BET水2管作阴性对照，所有测试管的OD值均需减去阴性对照管OD值后计算浓度，此外要增加大于1 EUml内毒素液作阳性对照。重复4次，用直线回归方程统计，其相关系数（r）应等于或大于0.98（r0.98）其内毒素稀释液OD值的最高最低之差不得小于0.4。3.4.3 计算式：式中：x轴为内毒素工作品稀释浓度y轴为测得的OD值内毒素4个稀释度为0.25、0.125、0.06、0.03 EUml的OD值分

6、别为0.826、0.436、0.163、0.087，n4。x0.465（x）22.162 x20.0826y1.512（y）22.2861y20.9065r0.9978Sx0.0976Sy0.3342斜率3.4197 截距0.01954示例4.1葡萄糖氯化钠注射液将原液（A）用BET水12倍连续稀释2次即12（B）与14（C）各加入1.0 EUml内毒素工作品稀释液，每稀释一步都要混合30 s，其测试读出OD值，按上述标准曲线公式计算，内毒素浓度结果(见表1)。表1内毒素浓度计算结果内毒素标准液ABCEUmlODEUmlODEUmlODEUmlODEUml0.0200.0230.0440.21

7、2几何均数相关系数回收率上述结果其相关系数均大于0.98，其最高、最低之差的OD值均大于0.4，合乎标准曲线要求，内毒素的回收率在50200之间6可用A组制订的标准曲线来判别。4.25葡萄糖注射液：按方法稀释12倍，结果(见表2)。 表2稀释12倍结果ABEUmlODEUml几何均数相关系数回收率73.8101.6上述结果表明，其相关系数均大于0.98，其最高最低点OD值大于0.4合乎标准曲线要求。内毒素的回收率在50200之间也可用A组制订的标准曲线判别。4.3盐酸阿霉素配制成1 mgml液体，同上述方法加入1 EUml内毒素溶液，制成0.25、0.125、0.06、0.03系列浓度，检测O

8、D值分别为0.801、0.346、0.165、0.063按标准曲线公式计算其内毒素浓度分别为0.240、0.107、0.054、0.024 EUml；其几何均值为0.076，相关系数为0.9980其最高点最低点之差大于0.4，符合标准曲线要求，其回收率达到85.2。4.4妥布霉素样品4个，配制成1 mgml溶液检测，分别OD值为0.836、1.006、2.480、0.035、OD值，按上述内毒素工作品标准曲线计算其内毒素量分别为0.25、0.3、0.73、0.16 EUml。 5讨论5.1用产色基质法鲎试剂制订内毒素标准曲线，应用在葡萄糖氯化钠注射液，5葡萄糖注射液，盐酸阿霉素，妥布霉素等建立

9、标准曲线与进行回收试验确定内毒素量值明确，达到标准曲线与回收试验的要求6，7。5.2所测定的OD值是由分光光度计自动减除阴性对照管。用药液作阴性对照管时，要求选用无检测量内毒素的药液代替阴性水，产色法其测试管OD读数可以阴性对照管排除药液本身以及参予反应试剂本身的污染等使干扰(回收)试验更可靠。5.3从4个未知妥布霉素检品测定结果可见，用产色基质鉴别内毒素含量很明确，其中0.73 EUml的OD值为2.483超过仪器限度，将其比色液稀释后再测，可以确定其含量，也可将样本同倍稀释再行检测，无明显偏差。5.4本研究用0.25 EUml灵敏度凝胶法鲎试剂作对照，OD值在0.706即0.21 EUml

10、时均是坚实凝胶。5.5本研究是将定量产色基质鲎试剂应用于细菌内毒素检查法的扩大应用的药品、生物制品质量控制可行性试验，我们的报告依据只作检测的方法学研究报道和参考，要作为正式代替热原检查应由药品生产厂方提供数据。实验指导者：王绍明作者单位：福州东方鲎试剂厂参考文献1Salliven D T，et al：Appl Microbiol 1974；28（6）：10232Yanug.N.s，et al：J Clin Investy 1992；51：17903Iwanaga.S et al：Halmorstaris 1978；7：1834原田敏枝一他：医用酵素 1978；3：435T.Obayashi et al：Clin Chem 1985；149：556中国药典2000年版(二部)新增与修订内容汇编(初稿)第347页7Gui