多能干细胞相关载体及其安全性的研究进展 - 副本

1、研究生课程论文多能干细胞相关载体及其安全性的研究进展课程科目 专 题 讨 论 授课教师 庞 全 海 2013 级 硕士 研究生 卢杰丽 学 号 20132348 多能干细胞相关载体及其安全性的研究进展摘要：目前人类已能将鼠和人的体细胞，通过转导Oct3/4，Sox2，Klf4和c-Myc等基因成功改造成诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPS cell），这使再生医学领域的研究成为热点。诱导多能干细胞(i nduced pl uri potent stem cel l s, i PS 细胞)不仅具有与胚胎干细胞(embryoni c stemcel l

2、 , ESC)相似的各项特性，相对于 ESC，iPS 细胞，尤其患者特异性 iPS 细胞还具有来源方便、不存在免疫排斥和伦理问题以及可以保留特定个体基因型等优点，为再生医学提供了可能的细胞来源。尽管目前诱导多能干细胞的临床应用及载药材料的研究仍面临着诸多技术问题，但随着诱导技术和载体种类的不断改进，诱导多能干细胞的临床应用指日可待。文章综述诱导多能干细胞在载体方面的最新研究进展。关键词: 诱导多能干细胞；病毒载体诱导；质粒载体诱导；酶切系统诱导；重组蛋白诱导；安全性；诱导效率2006年日本京都大学的Takahashi等1首次报道，将选择的特定外源性转录因子导入小鼠的成纤维细胞，可以成功诱导出多

3、能性的类胚胎干细胞，他们把这类细胞命名为-诱导多能干细胞（iPS cell）。这一新的突破在理论上首次证实了已分化成熟的体细胞同样可以被重编程而转化为类胚胎干细胞，且成功地解决了难以突破的伦理及免疫排斥问题，为再生医学增加了一个新途径。运用此重编程技术能从特定疾病的患者体内提取成体细胞，进而诱导成疾病特异蚤孕杂细胞。疾病特异蚤孕杂细胞的诱导成功更为体外研究遗传疾病发生、发展和组织形成提供了更加广泛和大量的研究模型，并将有力推动基因治疗和药物研发。但是，重编程外源基因组及使用病毒载体会影响ips细胞基因组，即可能引发潜在的插入性肿瘤和干扰诱导多能干细胞分化。因此，寻找合适的载体是诱导多能干细胞技

4、术的重要研究课题。载体是由质粒、噬菌体及病毒衍生而来的，具有携带功能的DNA分子，在载体中可插入外源基因片断，通过转化、转染或利用病毒进入细胞的机制导入到一个宿主细胞中，并在其中进行复制或表达。1 使用病毒载体诱导ips细胞1.1 以逆转录病毒和慢病毒为载体 2007年Okita等2报道，以逆转录病毒为载体，将Oct3/4，Sox2，Klf4和c-Myc等4种因子导入人类成纤维细胞，成功诱导成类胚胎干细胞。几乎与之同时，美国科学家Yu等3也成功地将人类成纤维细胞诱导成类胚胎干细胞。与Okita研究组所不同的是，Yu等运用的载体为慢病毒，所采用的转录因子是通过自筛而确定的4种因子组合，即Oct3

5、/4，Sox2，Nanog和Lin28。结果显示，生成ips细胞与人的类胚胎干细胞特性高度一致。随后，研究小组将ips细胞注入先天免疫缺陷的裸鼠皮下，得到包含三胚层细胞的畸胎瘤，进一步证实其具有类似胚胎干细胞的发育潜能。使用逆转录病毒或慢病毒作为载体转染体细胞诱导成ips细胞的方法，因其直接使外源性基因和载体整合到受体体内的基因组，会引起插入突变以干扰正常的ips细胞系的功能，而细胞中残余的外源因子序列的表达会影响分化，甚至有导致肿瘤发生的危险性。特别是原癌基因c-Myc的导入，由其构建的嵌合体小鼠中约20%发生了肿瘤3。因此，目前很多学者已采用其他方法替代原癌基因c-Myc的转导，而以逆转录

6、病毒和慢病毒为载体诱导ips细胞的临床应用也受到了极大的限制。1.2 以腺病毒为载体 2008年Stadtfeld等4报道，使用腺病毒载体转染Oct4，Sox2,ccc-Myc和Klf44种因子，成功地将小鼠肝细胞改造成ips细胞。研究者使用聚合酶链式反应和Southern blotting等方法未发现腺病毒载体基因组及转导因子基因组整合到宿主细胞基因组中的迹象。与逆转录病毒、慢病毒相比，腺病毒载体可以使外源基因组不会整合到宿主细胞基因组当中，解决了外源基因组对ips细胞分化干扰的难题。然而，以腺病毒为载体诱导ips细胞的效率非常低（0.0001%-0.0018%），比逆转录病毒为载体的诱导率

7、（0.1%）低很多，这就限制了其临床应用。2 使用质粒载体诱导ips细胞2.1 以质粒为载体 2008年日本学者Okita等5使用质粒为载体，携带转染所需的因子基因，成功地将小鼠成纤维细胞诱导成类胚胎干细胞-ips细胞。这种方法不仅防止了病毒载体基因组整合到宿主细胞基因组中，同时可以防止外源基因干扰ips细胞的分化。Okita等利用质粒的自我复制和转录等特性设计了两种携带转染因子的质粒改造小鼠成纤维细胞，一种为pCX-OKS-2A，其由一段2A肽（ 来自口蹄疫病毒，具有自我清除作用）携带Oct4,Sox2和Klf4三种转导基因；另一种是pCX-c-Myc，由一段2A肽携带c-Myc转染基因。两

8、种质粒经多次瞬间转染，将小鼠成纤维细胞诱导成ips细胞。此法大大消除了插入性肿瘤形成的风险及再激活癌基因的可能性。但其仍然无法突破一个障碍ips细胞诱导率极低。采用此法转导1×106个成体细胞只成功改造了1-29个ips细胞，而在同样的实验条件下，采用逆转录病毒作为载体却能成功转染1-1000个ips细胞6。西班牙学者Gonzalez等7改进了Okita研究组的方法，他们采用一个质粒载体就将小鼠胚胎成纤维细胞成功地诱导出ips细胞，并设计出一个含Oct4,Sox2和Klf4和c-Myc四种转导基因的多顺反子质粒载体pCAG-OS-KM，通过瞬间转染的方法改造小鼠胚胎成纤维细胞成ips

9、细胞。但诱导率仍很低。2.2 以oriP/EBNA1质粒为载体 Yu等8于2009年利用oriP/EBNA1质粒，首次生成无外源基因重编程的人ips细胞。EBNA1和oriP是EB病中与复制和保持病毒基因组游离性的重要基因元件。具有oriP/EBNA1的质粒转染人靶细胞后不整合，并可长期稳定存在，不会造成宿主细胞的突变。同时，由于其具有增强转录及免疫逃逸等功能，使质粒携带的目的基因能够获得较高的转染效率9。Yu工作小组经研究得出，当oriP/EBNA1质粒只整合Oct4,Sox2，Nanog及Lin28四种外源基因，其改造人新生儿包皮成纤维细胞的成功率为0.1%，但当再增加Klf4和c-Myc

10、转导基因后，其诱导成功率则增加员10倍。3 使用酶切系统诱导ips细胞3.1 利用Cre/LoxP重组系统 Soldner等10从帕金森患者身上提取成纤维细胞核利用强力霉素诱导的慢病毒载体，通过酶切Cre/LoxP重组系统成功地培育出不含外源基因的人ips细胞。酶切Cre/LoxP系统可以使某一基因在特定的组织、细胞中，在细胞分化，成熟过程的某一时段被剔除，以减轻其带来的副作用。这虽能除去外源因子序列，但载体序列仍会有残留，因此仍可能造成插入性突变。此外采用这种方法诱导的成功率仍然很低，转染Oct4,Sox2和Klf4和c-Myc4种基因后，其诱导成功率只有0.01%11。3.2 利用pigg

11、yBac转座子 Yusa等12报道，利用piggyBac转座子方法，将小鼠胚胎成纤维细胞成功地改造成ips细胞。piggyBac是一种从粉纹夜蛾中分离到的、具有TTAA插入位点特异性的DNA转座子。piggyBac可在昆虫基因组中准确切离，转化频率较高，且不受宿主因子的限制13。Yusa研究小组设计了含有piggyBac转座子系统、具有自我清除作用的F2A肽及T2A的载体，转染Oct4,Sox2和Klf4和c-Myc基因。此载体能通过piggyBac转座子系统形成的转座F2A肽和T2A肽切除插入的外源基因和载体序列，因此，得到的ips细胞不会留下外源基因组的“ 足迹”，可更好地应用于临床。更重

12、要的是利用piggyBac转座子转染Oct4,Sox2和Klf4和c-Myc基因能使转导率达到1%，相当于以逆转录病毒为载体的转导率。4 使用重组蛋白诱导ips细胞 2009年Zhou等将重组蛋白（Oct4-11R、Sox2-11R、Klf4-11R和c-Myc-11R）转入小鼠胚胎成纤维细胞，成功地诱导出类胚胎干细胞-蛋白诱导多能干细胞。这一技术在诱导ips细胞领域里产生了重大的突破，能在不涉及基因组调节的情况下，只凭借蛋白质就能将小鼠胚胎成纤维细胞诱导成ips细胞，这一技术大大简化了将细胞重编程为类胚胎干细胞的常用技术的繁琐步骤。Zhou的研究小组首先将Oct4,Sox2和Klf4和c-M

13、yc基因重编程大肠杆菌细胞，促使大肠杆菌表达源种基因，形成的蛋白经过正确折叠、修饰、纯化和连接目标肽，在目标肽的引导下通过渗透法进入小鼠胚胎成纤维细胞，发挥诱导功能。实验证实只有通过反复多次的转入重组蛋白，才可能诱导出类胚胎干细胞。这种方法与之前诱导多功能干细胞的方法相比有以下2点优势：（1）有效地消除了外源基因和序列对细胞基因的修改造成的风险；（2）蛋白转导的方法更加简单快速、经济实用。然而，缺点就是难以提高转导效率，在转导源种重组蛋白及组蛋白脱乙酰化酶抑制剂丙戊酸（也能提高Oct4,Sox2和Klf4基因诱导的成纤维细胞重编程效率）的作用下，仅能将5×104个小鼠胚胎成纤维细胞成

14、功改造得到3个ips杂细胞。5 i PS细胞临床应用的安全性长期观察发现，借助反转录病毒向细胞导入 Oct4、Kl f4、Sox2、c- M yc等因子诱导的i PS 细胞导入小鼠体内后极易生长肿瘤 14 。究其原因，可能是因为诱导因子中含有致癌基因 c- M yc，逆转录病毒附带的一些因子误激活了宿主的一些致癌基因，或者是反转录病毒本身诱导细胞产生了肿瘤等。这些都是i PS 细胞走向临床的巨大障碍。为了解决这个问题，国际上很多实验室尝试在不带入逆转录病毒的情况下诱导 i PS 细胞的产生，并取得了巨大的成功。Stadtfel d等 15 和 Oki ta等 16 先后利用不容易整合到宿主基因

15、的腺病毒及质粒为载体向目的细胞导入上述 4 个因子诱导 i PS细胞产生 ；Wol tj en等 17 利用piggyBac为中介向细胞内导入上述4 个因子诱导 i PS 细胞；Gonzal ez等 18 则利用单个多顺反子的媒介同时导入上述 4 个因子的方法诱导 i PS 细胞；Zhou等 19 将 Yamanaka因子的蛋白质产物导入细胞诱导i PS 细胞。结果，这些方式都在不带入逆转录病毒的情况下成功产生了 i PS 细胞，而且这些i PS 细胞同样能表达ESC 的典型标志，如 NANOG 、SOX- 2、SSEA- 1 等并能分化出三胚层，表现出与由逆转录病毒诱导的i PS细胞和ESC

16、极为相似的特性。由此 i PS 细胞的安全性得到了可靠的提高。当然，癌症发生的危险性虽然能通过这些方式大大降低，但是在没有完全阐明 iPS 细胞产生机制之前，我们仍然不能说 iPS 细胞应用于临床就是安全的，i PS细胞的安全性和潜在危险性都需要通过长期的观察和实验加以证实。此外，与 ESC 相似，如果 i PS细胞不经诱导定向分化就导入受体体内亦存在产生畸胎瘤的风险。6 结语ips细胞研究在短短几年时间里已取得重大的突破，为避免重编程外源基因可能导致受体发生插入性肿瘤及影响细胞分化等潜在性危险，应尽量减少外源基因的整合。从2006年Takahashi等转导Oct4,Sox2和Klf4和c-M

17、yc等24种因子到如今Kim等只转导Oct4一个基因就诱导得到ips细胞，可见其研究进展是迅速的。科学家首次诱导ips细胞使用了逆转录病毒，出现了载体的序列整合到宿主细胞基因组，存在癌基因激活的危险。因此，研究者又陆续研发了慢病毒、腺病毒、质粒载体，重组蛋白转染成体细胞诱导得到ips细胞，大大减少了外源基因的整合，然而科学家在设计出更安全的载体后，又普遍出现了诱导效率低下的困惑，这严重影响了诱导多能干细胞的临床应用及药物开发。因此，ips细胞领域的研究者都期待着在不转导外来基因组的情况下，通过蛋白转导或寻找更适合的诱导细胞和载体技术，创造出更安全、更高效、更稳定的ips细胞。参考文献：1 Ta

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