真菌SF―21483产生的活性物质分离纯化及初步确认

1、真菌SF 21483产生的活性物质分离纯化及初步确认摘要：从武汉地区土壤中分离得到一株真菌菌株SF-21483,其发酵液具有较强的抑制真菌的作用。本研究以 真菌SF-21483发酵提取物中的活性代谢产物为研究对象，应用高效制备液相色谱经过 2 次分离纯化， 得到了 5 个化合物。 根据紫外吸收光谱、分子离子峰、物理性状及活性情况等确 定组分 4、 5、7、 9、 1 0 与冬青生菌素( Ilicicolin ) F、 E、 D、 C、H 较为相似， 对植物病原菌生物活性测试表明， 该类组分 具有较强的抗菌作用。关键词：真菌菌株 SF-21483；农药活性物质；分离；纯 化；冬青生菌素( Ili

2、cicolin )中图分类号： S482.2 文献标识码： A 文章编号： 0439-8114(2015)17-4188-04DOI： 从微生物中筛选天然物质始于 1929 年青霉素的发现， 自 20 世纪 40 年代，至今已发现一万余种抗菌素 1 。微生物 在其生长过程中会产生一些初生及次生代谢产物。农用抗生 素是微生物产生的次级代谢产物，可用于防治农业有害生物， 是一类用途很广泛、 产业化程度很高的生物农药 2。本研 究在武汉某地土样中分离得到一株真菌菌株(编号为SF-21483），寸SF-21483的发酵提取物进行化学成分的分析， 从中分离到5个化合物，研究包括真菌SF-21483的发酵

3、、提 取、分离纯化，初步确定其结构及生物学活性。1 材料与方法1.1 材料培养基 种子培养基：麦芽糖 6.25 g,麦芽提取物6.25 g,酵母提取物1.00 g,磷酸二氢钾1.25 g,硫酸镁 0.625 g,蛋白胨 0.625 g，琼脂粉15.00 g，去离子水1 000 mL。摇瓶发酵培养基：葡萄糖 72.00 g,蛋白胨8.00 g, 酵母 提取物4.00 g,磷酸二氢钾2.00 g,硫酸镁1.00 g,盐酸硫胺 0.10 g, pH 6.0,去离子水 1 000 mL。主要仪器 Water 2695 高效液相色谱仪（ Waters996二级管阵列检测器，色谱工作站MasslynxV4

4、.0）,高效制备液相色谱仪 （ Waters2525 泵，带 2767 自动收集系统， 2996 二级管阵列检测器，色谱工作站MasslynxV4.0）；高效液相色 谱-质谱联用仪： Waters 2695高效液相色谱系统,美国 Micromass Quattro micro ？?R 质谱仪（电喷雾离子源 （ESI）, Masslynx V4.1 液质联用分析软件。主要试剂 甲醇（色谱纯，德国 CNW）,乙腈（色 谱纯，德国CNW）,去离子水（Millipore ）。液质联用分析所 用的高纯氮气购自武汉和远汉盛气体有限公司，纯度为 99.999%。菌株来源 真菌菌种SF-21483由湖北省农业

5、科学 院生物农药工程研究中心分离、 保存。黄色镰刀菌 ( Fusarium culmorum )、立枯丝核菌( Rhizoctonia solani )、葡萄灰霉 (Botrytis cinema )、小麦颖枯病菌( Septoria nodorum )、番 茄早疫菌( Alternaria solani )，由湖北省农业科学院生物农药 工程研究中心提供。1.2 色谱条件1.2.1 分析条件 色谱柱：美国 Sunfire？?R C18 柱，150 mm X 2.1 mm (i.d),粒径3.5卩m。柱温40 C。流动相：A.去离子水；B.乙腈(梯度洗脱)。进样量3卩L。流速0.3 mL/min

6、。检测条件：PDA全波长扫描。1.2.2 制备条件 色谱柱： 美国 Sunfire？?R OBD C18 Prep 柱，250 mm X 19 mm (i.d),粒径10卩m。柱温室温。流动 相：A.去离子水；B.乙腈(梯度洗脱)。进样量3 000卩L。 流速27 mL/min。检测条件：PDA全波长扫描。质谱检测条件MS条件：电喷雾电离(ES),毛细管电压为3.5 kV，锥孔电压为45 V,离子源温度为 100 C, 脱溶剂温度为300 C,脱溶剂气体流速 500 L/h，锥孔气体 流速为 50 L/h。1.3 方法种子培养 用无菌接种环从斜面中取少量孢子或菌丝转入种子培养基中，在旋转式摇床

7、上28 C、130140 r/min培养96 h。每次每菌株准备10瓶。移种前，对每瓶种 子进行取样镜检，以排除有污染的摇瓶。1.3.2 摇瓶发酵 待种子培养好时，转入 500 mL 锥形瓶 中装样100 mL,接种后的锥形瓶置于旋转式摇床上 28 C、 130 140 r/min 培养 7 d。133活性物质的提取 将真菌SF-21483发酵液离心，分 别将菌丝体和上清用乙酸乙酯进行提取 2 次，合并提取液， 真空减压浓缩至干，加入适量甲醇，离心，备用。1.3.4 活性成分分布 取少量备用液进行半制备，所用色 谱柱为美国 Sunfire ? ?RC18反相柱(10卩m, 250 mm x 1

8、0 mm),进样体积800卩L,柱温为室温，流速为7.5 mL/min , 流动相为乙腈和去离子水， 采用梯度洗脱， 乙腈的浓度在 25 min 内由 5%变至 100%。每分钟收集一个组分，用干净空气 吹干后进行生物活性测定，确定活性成分分布位置。1.3.5 纯品的制备 根据 活性分布结果，确定活性 部位的保留时间。先采用分析液相摸索出适合活性化合物分 离的流动相梯度。然后将此梯度直接放大到制备液相中，分 离纯化出活性物质单组分，制备时所用色谱柱为美国Sunfire? ?Rprep-C18反相柱(5 卩 m, 19 mm x 250 mm),进 样体积2 000卩L,柱温为室温，流速为 27

9、 mL/min。1.3.6 组分纯度及分子量的测定 将 分离纯化的单组分 化合物干燥，溶于色谱级甲醇中，取 1 mL于LC-MS检测， 确定化合物的纯度及分子离子峰，根据紫外吸收光谱、分子 离子峰及碎片离子判断化合物的归属。2 结果与分析2.1真菌SF-21483发酵提取物中活性组分的测定半制备活性跟踪试验显示，主要活性组分出现在 2026min 内。结果表明，此段组分具有较强的抗真菌活性，其余 保留时间均无活性（图 1）。通过图 1 可知， 20 26 min 的组 分主要有 peak 1 9 . 90 、 peak2 3 . 4 2 、 peak2 4 . 77 和 peak25 . 8

10、2 。2.2真菌SF-21483活性化合物的分离纯化根据 2.1 活性分布结果，明确活性部位的保留时间分布在2026 min。由此，先采用分析液相考察在色谱条件梯度下保留此时间段的分离度。 检测结果表明， 2026 min 时段内组分较为集中，分离度较小。虽然半制备结果表明主 要含有5个活性组分，但是LC-MS检测结果表明2026 min 时段内含有较多的化合物 （图 2），这可能和分析柱的柱效较 高有关。本试验半制备的色谱柱粒径10卩m，而分析液相色谱柱的粒径为3.5卩m，柱效（理论塔板数）远高于半制 备色谱柱 3。因而在分析条件下，更能清晰的检测出相同时 间段所有组分。这些化合物的紫外最大

11、吸收值较为接近，均 在 230、290、345 nm 左右，由此判断，可能是同系物或者 类似物。 因为这些化合物均集中在 2026 min 时段内， 此段 化合物属于中等偏弱极性化合物。对此较为集中且组分较多的样品分离纯化，先采用梯度 1 条件，每个峰均收集。然后 根据梯度 1 的保留时间段流动相配比，设计出梯度24 ，将这些收集到的组分再进一步分离纯化，得到了 5 个纯度较高 的化合物，这些化合物的理化性质见表2。2.3真菌SF-21483发酵提取物中的各活性组分LC-MS归属将得到的 5 个化合物分别称量 1 mg 溶于 1 mL 甲醇中， 于LC-MS上进样5卩L,测定各个组分的分子离子

12、峰 （表3）。 由表 3可知，这5个活性组分的分子离子峰分别为4（462.2）、5（402.2）、7（404.2）、9（406.2）、10（433.3）。紫外吸收 光谱也较为接近，最大吸收值分别在230、 290、 345 左右。对比这些化合物紫外吸收光谱、相对分子质量、物理性状、 来源及生物活性，经过查询天然产物化合物词典（DNP）和文献，初步推断 4、5、7、9、10这 5个组分与冬青生菌素 较为接近 5-7 。冬青生菌素是由真菌 Cylinddrocladium ilicicola MFC-870 产生的抗生素8，9，含有 A、B、C、D、E、F、G 和H等8个组分。相对分子质量分别为

13、A 390、B 356、C 406、D 404、 E 402、 F 462、 G 404、 H 433，最大紫外吸收值分别 为 A ：230、 296、 344， B： 233、 296、 340， C： 230、 295、 347， D： 240、 250、 292、 346， E： 240、 290、 346， F： 240、 294、 348， G：230、 295、 349， H： 248、 349。而 4、 5、 7、 9、 10 这 5 个活性组分是由真菌菌株 SF-21483产生，分子离子峰分别为 4（ 462.2）、5（402.2）、7（404.2）、 9（406.2）、10（

14、433.3）。紫外吸收值也较为接近：4（ 242、292、337）、5（236、291、337）、7（237、298、338）、9（230、 292、 348）、 10（ 245、347）。物理性状分别为 4（淡黄色结 晶）、5（淡黄色结晶） 、7（淡黄色结晶） 、9（黄色针状结晶） 、 10（黄色针状结晶） 。结果表明， 5 个组分均具有一定的抗真 菌活性。由此判断，活性组分 4为冬青生菌素 F（Ilicicolin F）、 活性组分5为冬青生菌素E（llicicolin E）、活性组分7为冬青 生菌素D （llicicolin D ）、活性组分9为冬青生菌素 C （llicicolin C

15、）、活性组分10为冬青生菌素H （llicicolin H ）。2.4 SF-21483发酵提取物中各活性组分的抑菌活性将SF-21483发酵提取物分离纯化得到的这5个活性组分分别在 5 个真菌病原菌靶标下的1.0、 0.3、 0.1 mg/mL 浓度下进行生物活性测试，结果表明，这些活性组分均具有一定的 抑制植物病原真菌的作用（表4）。由表 4可知，活性组分 4仅在 1.0 mg/mL 浓度下有活性；活性组分 4在 3个浓度下均 对小麦颖枯、立枯丝核菌均有较强的抑制作用；活性组分 5 的活性最强，在 3个浓度下对其中的 3个靶标均具有较强的 活性；活性组分 9 对小麦颖枯、番茄早疫在 3 个

16、浓度下有较 强的活性；活性组分 10对葡萄灰霉、番茄早疫、立枯丝核 具有一定的抑制作用。3 小结与讨论本试验从 SF-21483 的发酵提取物中分离得到的组分4、5、7、9、10与化合物冬青生菌素（llicicolins）相似，具有 较强抗真菌作用。文献研究多集中在llicicolin H ,它是2-吡啶 酮类化合物。体外抗菌活性研究表明，该化合物抑制炭疽杆 菌（Bacillus anthracis）的剂量为 6 mg/mL8。其作用机制在 最近才被阐明，在酵母中作用于线粒体， 抑制呼吸链中泛 醌位点 10 。目前该类化合物的研究主要集中在抗菌机理上， 在农药应用方面的研究很少报道。本试验主要

17、是从真菌 SF-21483的次生代谢产物应用于植物病原菌的防治上进行了 研究，为真菌SF-21483在农业上的应用做了初步的探讨。参考文献：1 B ？ ?RDY J. Bioactive microbial metabolitesJ. J Antibiot ， 2005， 58（1）：1-26.2 朱昌雄， 蒋细良，姬军红，等 .我国生物农药的研究进展及对未来发展建议J.现代化工， 2003， 23（7）：1-4.3 刘国诠，于兆楼 .色谱柱技术 M. 第二版 .北京：化学 工业出版社， 2005.4 张亚妮，王开梅， 张志刚， 等.放线菌菌株 WS-13182 产生的活性物质的分离纯化J湖南

18、农业科学，2009（ 11）： 33-36.5 GUTl？?RREZ M， THEODULOZ C， RODR？ ?QUEZ J， etal. Bioactive metabolites from the fungus Nectria galligena ， the main apple canker agent in ChileJ. J Agric Food Chem， 2005，53(20)：7701-7708.6 SINGH S B， LIU W G， LI X H， et al. Antifungal spectrum ， in vivo efficacy ， and structure-activity relationship of ilicicolin hJ.ACS medicinal