乙型脑炎减毒活疫苗细菌内毒素检查凝胶法研究

1、乙型脑炎减毒活疫苗细菌内毒素检查凝胶法研究建立乙型脑炎减毒活疫苗细菌内毒素检查方法和质量标准， 检测样品中的内毒素含量。 方 法 中国药典 2010 年版三部细菌内毒素检查法 （凝胶限度试验、 凝胶半定量试验 ） 。结果 选 用入为0.5 EU/ml的鲎试剂，采用凝胶限度法对乙型脑炎减毒活疫苗进行细菌内毒素检查， 样品经稀释至 80 倍或以上稀释度后对内毒素检查均无干扰，确定该疫苗的内毒素限度值为40 EU/ml即20 EU/剂（0.5 ml）。凝胶限度试验结果显示，疫苗每 1 ml中含内毒素的量均小 于40 EU，即每1次人用剂量（0.5 ml）中含内毒素的量均小于 20 EU。凝胶半定量测

2、定结果显 示，1人份规格疫苗中含内毒素的量为2.5010.00 EU/ml（平均5.36 EU/ml）； 5人份规格疫苗中含内毒素的量为 1.506.00 EU/ml（平均3.02 EU/ml）。结论 凝胶法两种试验均可用于乙型 脑炎减毒活疫苗细菌内毒素检查， 与凝胶半定量试验相比， 凝胶限度试验更为简便、 且易于 操作；采用凝胶限度法本研究建立了乙型脑炎减毒活疫苗细菌内毒素检查方法和质量标准； 凝胶半定量法测定结果用准确数据显示该疫苗的内毒素含量均在人体安全限度以内。流行性乙型脑炎 （筒称乙脑 ）是危害儿童身体健康较严重的一种传染病，目前疫苗接种是预防 乙脑的有效措施。 SA14-14-2

3、株乙型脑炎减毒活疫苗 （简称乙脑活疫苗 ）是我国独创的一种安 全、有效的预防性生物制品， 自 1 988年被批准在卫生部成都生物制品研究所首家生产以来， 已累计在国内外上市十余亿人份。该产品已先后被中国生物制品规程13、中国药典45和世界卫生组织（WHO）规程收载，但目前尚未被现行版美国药典7、欧洲药典8和英国药典 9收载。 中国药典 2010 年版三部收载的乙型脑炎减毒活疫苗未规定对 制品进行细菌内毒素检查， WHO 规程对此项也未作规定。为建立乙脑活疫苗细菌内毒素检 查方法和质量标准， 控制生产过程中可能源自细菌内毒素的污染， 进一步提高产品的安全性， 根据国家药典委员会病毒专业委员会的专

4、家建议， 现采用中国药典 细菌内毒素检查法 5 中凝胶限度试验和凝胶半定量试验方法， 对成都生物制品研究所 （简称成都生研所 ）生产的乙 脑活疫苗 （规格:1 人份/瓶、 5人份/瓶）进行细菌内毒素检查研究。1 材料与方法1.1 材料、仪器1.1.1 试验样品 为冻干注射剂，由成都生物制品研究所提供。乙脑活疫苗（ 1 人份/瓶） 11 批，批号： 201007A091-3 、 201008A096-3 、 201010A099-2 、 201010A112-2 、 201011A114-4、 201 1 02A050-2 、 201 1 03A082-4 、 201 1 03A085-2 、

5、201 1 04A090-2 、 201 1 04A091-3 、 201 1 06A1 32-3 。 乙脑活疫苗（ 5 人份 /瓶） 11 批，批号： 200901C004-3、 200901C009-3、 200901C012-2、 200906C014-3 、 20091 1C01 6-1 、 201 002C001-3 、 201 003C01 7-1 、 201 004C028-2、 201 004C033-1 、 201004C045-3、 201 005C064-3 。1.1.2细菌内毒素工作标准品：规格： 120EU/支，批号：150601-200963，购自中国药品生物 制品

6、检定所。1.1.3 鲎试剂 灵敏度： 0.5EU/ml ，批号： 1 006 1 0 1 ，由湛江安度斯生物有限公司生产。灵敏 度： 0.5EU/ml ，批号： 10021512，由福州新北生化工业有限公司生产。1.1.4细菌内毒素检查用水规格：50ml/瓶，批号：1103100，由湛江安度斯生物有限公司生产。1.1.5 主要仪器 试管恒温仪（型号： TAL-40D ） , 由湛江安度斯生物有限公司生产。1.2 方法1.2.1供试品制备取本品（两种规格）,每瓶按标示量用疫苗稀释剂复溶（每人份0.5ml）,再用 BET 用水稀释，备用。1.2.2供试品细菌内毒素限值（L）及最大有效稀释倍数（MV

7、D ）确定 疫苗使用说明书显 示，乙脑活疫苗为冻干注射剂，主要免疫对象为 8 月龄以上健康儿童，皮下注射， 0.5ml/ 剂 量。根据文献 10, L（EU/ml）=K/M ，式中： K 为按规定的给药途径，人体每千克体重每小时（h）最大可接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热阈），计算单位EU/（kg.h）；M为按规定的给药途径，人体每千克体重每小时给药的最大剂量，计算单位ml/（kg.h）。根据注射剂 K=5EU/（kg.h），儿童体重（以10kg计）,注射时间（不足1h计为1h），注射剂量L=100EU/ml ，即为该疫苗供试品的内毒素理论限值。根据此理论限值， （0.5ml

8、） 中含内毒素的量应小于 50EU。c为供试品溶液浓度，入为鲎试剂灵敏度。根据选用鲎试剂的入为L以EU/ml表示，则c等于1.0ml/ml，计算得出 MVD=200。按药典 10方法进行。取本品 （两种规格 ），每瓶按标示量用疫苗稀释剂复溶（0.5ml/h），计算得出疫苗每 1 次人用剂量MVD=cL/入，式中0.5EU/ml ，本研究中1.2.3 鲎试剂灵敏度复核1.2.4 供试品干扰预试验 取本品 （两种规格 ），每瓶按标示量用疫苗稀释剂复溶（每人份0.5ml），再用 BET用水稀释至 10X、20X、40X、80X、160X、320X，选用两个厂家鲎 试剂（入=0.5EU/ml）按药典1

9、0方法对供试品原液及其稀释溶液进行检验。另设立阳性对照组2 管。），每瓶按标示量用疫苗稀释剂复溶（每人份（预试验中供试品无干扰的最小稀释度 ），选用（PC）、阴性对照组（NC）,每个浓度平行做1.2.5 供试品干扰试验 取本品 （两种规格0.5ml），再用BET用水稀释至确定的稀释倍数两个厂家鲎试剂（入=0.5EU/ml）按药典10方法进行干扰试验。1.2.6 供试品细菌内毒素检查 （凝胶法） 凝胶限度试验：取本品 （两种规格 ），每瓶按标示量 用疫苗稀释剂复溶（每人份0.5ml）,再用BET用水稀释至确定的稀释倍数 （参考选用鲎试剂灵 敏度），按药典 10 方法检查每 1ml 中所含内毒素的

10、限量值 （EU）。凝胶半定量试验：取本品（两种规格）,每瓶按标示量用疫苗稀释剂复溶 （每人份0.5ml），再用 BET 用水稀释，按药典 10 方法测定，通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含 量。2 结果与分析2.1 鲎试剂灵敏度复核试验 按药典 10方法进行， 2批鲎试剂反应终点值的计算结果均为 0.5EU/ml ，与鲎试剂标示灵敏度一致，可用标示灵敏度进行细菌内毒素检查。2.2 供试品干扰预试验结果 取批号为 201106A132-3（1 人份/瓶）和 201004C033-1（5 人份/瓶）的乙脑活疫苗，选用两个厂家鲎试剂（入=0.5EU/ml）进行干扰预试验（表1）。表1结果显

11、示，用批号为1006101的鲎试剂检测，供试品（201106A132-3）稀释倍数w 20倍时， 对BET试验有明显干扰，40倍时对试验无干扰；供试品（201004C033-1）稀释倍数w 10倍时，对BET试验有明显干扰，20倍时对试验无干扰。用批号为10021512的鲎试剂检测，两批供试品稀释倍数w 40倍时，对BET试验均有明显干扰，80倍时对试验均无干扰。 根据上述结果，当稀释倍数为 80 时，两批供试品溶液均不产生凝聚，且该稀释倍数小于 MDV，选稀释度1:80作为乙脑活疫苗供试品干扰试验稀释倍数。2.3 供试品干扰试验结果 取批号为 201106A132-3（1 人份/瓶）、 20

12、1004C033-1（5 人份/瓶）乙 脑活疫苗，稀释 80倍（预试验中无干扰的最小稀释倍数 ），选用两批（不同厂家）入=0.5EU/ml 的鲎试剂进行干扰试验，结果见表 2。1103100（水） /Es=0.50 /表2结果显示，在1:80稀释倍数下，Es值均在0.5入2.0入（0.251.0 EU/ml）之间，且Et在 0.52.0 Es之间，符合药典要求。表明两批乙脑活疫苗供试品稀释倍数 1:80时，对BET试 验均无干扰作用。根据干扰试验结果，选用不同批次鲎试剂2.4 乙脑活疫苗细菌内毒素限值拟定=0.5EU/ml） 检测， 乙脑活疫苗 （两种规格 ）供试品稀释至 80 倍时， 干扰试

13、验均成立。 表明在确 定的条件下， 采用凝胶限度法对乙脑活疫苗进行细菌内毒素检查具有可行性。根据本品使用说明书显示的人体 （儿童为主 ）用量，结合安全系数为2.5 加以考虑，将乙脑活疫苗的内毒素限值拟定为：取本品，每瓶按标示量用疫苗稀释剂复溶（每人份0.5ml），再用BET用水稀释，每1ml中含内毒素的量应小于40EU，即每1次人用剂量（0.5ml）中含内毒素的量应小于20EU。2.5供试品细菌内毒素检查结果2.5.1凝胶限度试验 鲎试剂（批号:10021512 ,福州新北）入为0.5EU/ml。取本品（两种规格各 10批）,每瓶按标示量用 0.5ml（1人份）或2.5ml（5人份）疫苗稀释剂

14、复溶，再用BET用水稀释 至 1:80，按拟定的标准检查（表 3）。2.5.2凝胶半定量试验：鲎试剂 （批号:10021512，福州新北）入为0.5EU/ml 取本品（两 种规格各10批），每瓶按标示量用0.5ml（1人份）或2.5ml（5人份）疫苗稀释剂复溶，按药典10 方法测定（表 4）。由表 4 结果可知， 1 人份规格疫苗的细菌内毒素含量为 2.5010.00EU/ml（ 平均 5.36EU/ml, 标 准差为1.54）, 5人份规格疫苗的细菌内毒素含量为1.50 6.00EU/ml（平均3.02EU/ml，标准差为 1.36）。3 讨论 中国药典 2010 年版三部对那些情况下该进行

15、细菌内毒素的干扰试验已有相关规定：细菌内 毒素检查法的相关规定， 当进行新药的内毒素检查试验前， 或无内毒素检查项的品种建立内 毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变、或试验环境发 生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。干扰试验（方法可行性试验 ）目的是要确定出供试品在什么样的有效浓度内进行细菌内毒素检查时既可克服干扰因素， 又 能客观反映其所含内毒素是否符合限值。6.08.0鲎试剂与内毒素的凝集反应受多种因素影响，如试剂质量、反应条件 （pH 值、温度、时间 ）、 反应物浓度、 有无干扰因子、 器皿洁净度等。 BET 法一般要求供试品溶液的 pH

16、 值在 范围， pH 值4 或10时会增加细菌内毒素假阴性结果出现的几率。环境温度对实验结果有 一定影响，室温在 28C以上时，随着操作时间延长，鲎试剂的灵敏度有所提高。因此，在 进行细菌内毒素检查时，应力求规范操作，排除干扰。 BET 法一般要求供试品溶液的 pH 在 6.08.0 范围，本试验乙脑活疫苗复溶后 pH 值在 7.28.0 范围，此供试品可直接用于实验。 采用凝胶限度法对成都生研所生产的乙脑活疫苗（两种规格 ）进行细菌内毒素检查，从干扰试验可看出， 受试乙脑活疫苗对鲎试剂与内毒素的凝集反应有叠加作用，该作用可通过将供试品稀释一定倍数而消除，与已有的文献报道10一致。用灵敏度为

17、0.5EU/ml 的鲎试剂检测，当供试品稀释至 80 倍时，供试品溶液均不产生凝集反应，鲎试剂与内毒素在水溶液和供试 品溶液中反应的比较未见差异， 表明在该浓度下供试品对细菌内毒素检查无干扰作用， 用凝 胶限度法对乙脑活疫苗进行细菌内毒素检查具有可行性。 乙脑活疫苗的免疫对象为 8月龄以 上健康儿童及由非疫区进入疫区的儿童和成人，根据人体致热阈值注射剂 K=5EU/（kg.h）和儿童 （体重以 10kg 计 ）每千克体重每小时给药的最大剂量 0.5ml/（kg.h） ，计算得出该疫苗的 内毒素理论限值为 100EU/ml 。根据本品临床用量结合安全系数为 2.5 加以考虑，将乙脑活 疫苗细菌内

18、毒素检查方法 （凝胶限度法 ）定为： 取本品， 每瓶按标示量用疫苗稀释剂复溶 （每人 份0.5ml），再用BET用水稀释，每1ml中含内毒素的量应小于 40EU ,即每1次人用剂量（0.5ml） 中含内毒素的量应小于 20EU。按拟定标准检验，两种规格各10批乙脑活疫苗的细菌内毒素检查结果均符合规定。采用凝胶半定量法对成都生研所生产的乙脑活疫苗（两种规格 ）进行细菌内毒素半定量测定，结果显示， 10 批 1 人份规格疫苗的内毒素含量为2.5010.00EU/ml ，10 批 5 人份规格疫苗的内毒素含量为 1.506.00EU/ml 。两种规格各 10 批乙脑活疫苗的内毒素含量均在 10EU/ml 以 下，远低于提高安全系数 2.5 倍拟定的内毒素限值 40EU/ml ，更加远远低于根据儿童给药最 大剂量计算的内毒素限值 100EU/ml ，因此我们认为成都生研所生产的乙脑活疫苗是安全可 靠的，按照规定的注射途径进行人体预防接种，该疫苗不会引起致热原反应。 研究表明，