DNA电化学生物传感器的原理与研究进展

1、第29卷第1期2009年3月CHEMICAL化学传感器SENSORSVol29, No1Mar 2009DNA 电化学生物传感器的原理与研究进展毛斌，韩根亮，马莉萍，刘斌，高晓平，李工农，刘国汉（甘肃省科学院传感技术研究所，甘肃兰州730000）摘要：DNA 电化学生物传感器是近年迅速发展起来的一种全新的生物传感器，该类传感器具有电极制作简便、使用寿命长、重现性好、灵敏度高、成本低、易于实现微型化等诸多优点，在临床医学检验、遗传工程、药物作用机理、新药筛选、环境监测和食品工程等领域已得到广泛地研究与应用。该文简单介绍了DNA 电化学生物传感器的基本原理，对其研究进展加以分类和简要评述，最后对其

2、发展方向进行了展望。关键词：DNA 电化学生物传感器；基本原理；研究进展Fundamentals and progresses of DNA electrochemical biosensorMao Bin , Han Gen-liang , Ma Li-ping , Liu Bin , Gao Xiao-ping , Li Gong-nong , Liu Guo-han(Institute of Sensor Technology , Gansu Academy of Sciences , Lanzhou 730000，ChinaAbstract ：DNA electrochemical b

3、iosensor, which has been developed rapidly in recent years, is one new type of biosensorsThis kind of biosensors has superiority in electrode fabrication, durable years, reproduction quality, testing sensitivity, production cost and micromation realizationSo they are of significant progress in resea

4、rch and application, such as clinical medical analysis, genetic engineering, mechanism of drug action, new drug selection, environmental monitoring and food engineeringThe fundamentals of DNA electrochemical biosensor is introduced, the progresses of the biosensor are assorted and appraised briefly

5、and its development trends is discussed in this articleKey words ：DNA electrochemical biosensor ；fundamentals ；progress0引言随着人类基因组计划（human genome project,分子作为敏感元件，制成用于DNA 快速测定1的传感器，可与电化学技术、荧光技术2、表面等离子体共振技术3和石英晶体微天平技术4等其它检测技术联用，能极大地提高基因检测速度。将电化学方法应用于DNA 生物传感器是近年来发展非常迅速的一个研究领域5。生物大分子DNA 与电化学转换器（电流型或电位型

6、的电极）组合即可构成DNA 电化学生物传感器。此类传感器具有电极制作简便、使用寿命长、重复性好、灵敏度高、成本低、能耗少、易携带、不破坏测试样品、不受溶液颜色影响、易于实现微型化等诸多优点5。研究DNA 电化学生物传感器技术对促进DNA 芯片技术发展也具有重要的指导意义6。目前利用电化学生物传感器可以准确HGP ）的实施，为基因疾病的诊治提供了科学依据，使得基因检测在分子生物学和生物医学研究中的重要性更突显出来。同时，人体、病毒和细菌核酸中特定碱基序列的检测在食品污染、法医鉴定和环境监测等领域已经开始发挥越来越重要的作用。大规模的基因分析要求使用更简便、迅速、廉价和微型化的检测装置。随着许多生

7、物新技术的出现，为开发高灵敏、高特异性的基因检测方法注入了活力，其中利用DNA 双链的碱基互补配对原则发展起来的各种DNA 生物传感技术，受到生物分析工作者的高度重视。利用DNA基金项目：甘肃省科学事业费项目(QS001C3201）通讯联系人，Tel：09318633673，Email：genlhanvipsinacom10化学传感器29卷ssDNA 的固定dsDNA 的杂交杂交指示剂的嵌入电化学检测 1期毛斌等：DNA 电化学生物传感器的原理与研究进展11图2共价键固定DNA 链的方法(a玻碳电极，(b碳糊电极，(c石墨电极，(d金电极，(e金电极，(f铂电极，(g多种基底电极Fig2Cov

8、alentbindingMethods of DNA ligands Immobilization(a glass carbon electrode，(b carbon paste electrode，(c graphite electrode，(d Au electrode，(e Au electrode，(f Pt electrode，(g many kinds of basic electrode择性地与dsDNA 结合，结合方式有：直接嵌入到DNA 片段的浓度。二茂铁及其衍生物18、亚甲基蓝等是常用的嵌入剂，一些金属复合物也能成为dsDNA 双螺旋的碱基之间，或通过静电作用与DNA 骨

9、架上的磷酸基团间的结合。电化学活性标识剂与电极表面的dsDNA 结合后，电化学检测到的信号大小或变化值可以反映电极表面DNA 杂交的指示剂，如钴复合物19、铷复合物20和锇复合物21。133利用无机纳米粒子的放大功能间接检测纳米材料具有的特异性质，可作为将ssDNAdsDNA 的多少，从而间接测定被测溶液中靶12化学传感器29卷固定到电极表面的基质，与其它电化学活性标识剂联用，使检测信号放大增强，从而间接检测靶已证明PNA 与互补核苷酸的杂交特性，在很多方面显示出优于ssDNA 的性能，有望被很好地用于基因诊断。DNA 片段的浓度。研究者们已将纳米金22、碳纳米管2324、纳米银2527等纳米

10、材料应用在该领域。其中纳米金颗粒具有小尺寸效应、表面效应和量子尺寸效应等，呈现出奇异的光学和电学性质，同时它还具有良好的生物相容性，宜与DNA 分子结合。上述这些性质使它在电化学DNA 生物传感器和基因芯片技术中得到广泛应用，例如：功能化的纳米金粒子、和其它金属构成复合纳米材料以及与磁性微粒2829相结合都是213DNA 损伤研究DNA 损伤物质的监测属于早期诊断和预防重大疾病的重要步骤之一。孙星炎等39以石墨电极为基底电极，研究了在不同致突变因素（包括紫外光照射、亚硝酸）的作用后，特定碱基序列的DNA 生物传感器和基因芯片技术的研究方向与热点。134利用酶分子的放大功能间接检测酶联放大反应的

11、电化学寡核苷酸实验与早期基于酶标记的免疫测定相似。在DNA 分子上标记酶作为识别元素，酶与底物作用时，有电化学响应信号。靶基因标记酶后，使检测电极与酶的底物作用，通过检测电化学信号，就可以间接检测靶DNA 。Kavanagh 等30将靶DNA 连上葡萄糖氧化酶，用修饰后的金电极间接检测靶DNA 。在已有的报道中研究最广泛的是过氧化酶3133，目前已实现商品化34。DNA 与电极表面的ssDNA 能否杂交及杂交程度，以此来探讨DNA 突变情况及可能的突变机理。Wang 等40直接固定dsDNA ，制备出微型电化学传感器，通过探讨紫外光辐射引起的DNA 中鸟嘌呤氧化峰信号的变化，检测DNA 的损伤

12、。214药物检验DNA 传感器在药物分析中的应用也越来越受到关注。Brett 等41利用DNA 修饰电极建立了对抗癌药卡铂的测定方法；Ov ádekov á等人42利用DNA 修饰电极研究了黄连素对癌细胞基因的作用；K erman 等人43建立了一种新型的杂交检测方法，有望用于制药和临床诊断；Gu 等人44研究了一种新型的碳糊电极可检测抗早孕药物米非司酮。2DNA 电化学生物传感器的应用现状将DNA 电化学生物传感器在各个领域的研究进展简要介绍如下：21在医学上的应用211细菌及病毒感染类疾病诊断在传统方法中，细菌及病毒感染类疾病是通过血液体外培养来诊断的，这需要几天甚至几

13、十天的时间，严重延误了疾病诊疗。利用DNA 电化学生物传感器可快速检测细菌和病毒，Hashimoto 等35利用光刻微细加工技术刻蚀出03mm 的固定DNA 探针微金膜电极，应用于测定乙型肝炎病毒。22在环境监测中的应用221环境有机物的监测Wang 等45报道了测定肼类化合物的电化学DNA 传感器，能灵敏测定水中的不同肼类化合物，检测限为1×109g mL 。还研究了46用于芳香胺类化合物测定的DNA 传感器，对芳香胺类化合物的检测限可达到纳摩尔数量级。Brett 等人47研究了DNA 电化学生物传感器，可检测三嗪衍生物引起的环境污染物。222环境病原微生物的监测大肠杆菌（Ecol

14、i）是一种致病菌，常会引起腹泻等疾病，Wang 等48利用丝网印刷转换器，研制了测定环境中EcoliDNA 序列的电化学生物传感器。212基因诊断223重金属离子的监测Millan 等36用ssDNA 修饰了碳糊电极，用该传感器测定了18个碱基长度的囊性纤维变性基因序列。Wang 等37对肿瘤抑制基因p53进行检测，取得满意的结果。Wang 等38提出以肽核酸（PNA ）代替ssDNA 作为探针修饰到电极表面，DNA 和重金属离子相互作用机理，是研究重金属对DNA 产生毒效作用的关键，也是近年来活跃的前沿研究领域之一4950。干宁等人51利用DNA 电化学生物传感器测定水中痕量铅，检测限为20

15、×108mol L 。1期毛斌等：DNA 电化学生物传感器的原理与研究进展1323食品工业231转基因食品的检测杜晓燕等52将生物素标记的ssDNA 通过生物素亲和素体系固载到铂电极上，识别转基因食品中的特异DNA 序列，该方法检测灵敏度高。化学DNA 生物传感器的研究将主要集中在以下几个方面：1）优化电极结构及ssDNA 的固定技术，例如发展自组装修饰技术等，提高ssDNA 的固定效果；2）结合其它技术如纳米技术等，获得更高灵敏度的检测；232食品新鲜程度的检测文献53报道上海科学家研制出新型DNA3）继续深入研究其在临床基因诊断、药物筛选等方面的应用；电化学生物传感器，能灵敏地检

16、测细胞中的能量分子三磷酸腺苷（ATP ）的含量。人工合成的DNA 只要碰上ATP ，双螺旋结构就会解链，导电性增强，因此只要测出电流的大小，就能知道ATP 的含量。该传感器可用于快捷地检测食品的新鲜程度。4）寻求其它技术与DNA 电化学生物传感器的结合，拓展其研究应用领域；5）应用肽核酸（peptide nucleic acid, PNA ）取代ssDNA ，以提高传感器的稳定性；6）实现人工智能化、微型化、商品化，使此类传感器渗透到人们的生活实践中。24基因芯片基因芯片是将分子生物学技术与半导体工业的微型制造技术结合，把巨大数量的寡核苷酸、肽核酸或DNA 分子固定在一块面积极小的基片（如：硅

17、片、玻片或尼龙膜等）上构成。经典的芯片检测一般采用同位素或荧光染料为信号报告分子，但都存在一定的缺点，如：灵敏度低、特异性不高、操作复杂、耗时长、有污染、需避光、半衰期短、易淬灭及不易检测等。从而长期制约着基因芯片的更为广泛地应用和发展54。因此寻求一种更安全、更方便简单、更灵敏特异的信号分子或检测手段是芯片技术研究的难点和热点。参考文献1Cilkowski M L ，Fanf M M, Lund M E JAsurface plasmonresonance method foe detecting multiple modes of DNAligand interactionwsJPharm

18、BiomedAnal ，2000，22（6）：103710452Pope L H ，Allen S ，Davies M C ，et alProbing DNADuplex Formation and DNA DrugInteractions by the Quartz Crystal Microbalance Technique JLangmuir，2001，17（26）：830083043Vercoutere W ，Akeson MBiosensors for DNA sequencedetectionJBiology，2002，6（6）：8168224Orpana A KFluoresce

19、nce resonance energy transfer(FRETusing ssDNA binding fluorescent dyeJBiomolEng,2004，21（2）：45505Wang JSurvey and summary from DNA biosensors togene chipsJNuclAcidsRes,2000，28（16）：301130166Mascini M ，Palchetti I ，Marrazza G ，et al DNA elec-trochemical biosensors JAnalChem,2001，369（1）：15227李家洲，刘耘，刘仲，等

20、DNA 传感器应用研究进展J传感器技术，2001，20（10）：138Brabec VDNAsensor for the determination of antitumorplatinum compoundsJElectrochemActa,2000，45：292929329王建龙DNA生物传感器在环境污染监测中的应用J生物化学与生物物理进展，2001，28（1）：12512810Pividori M I , Merkoci A , Alegret SElectrochemicalgenosensor design:immobilisation of oligonucleotides ont

21、o transducer surfaces and detection methods JDNA 电化学生物传感器技术具有诸多优点，其研究对完善DNA 芯片技术是有益尝试。Devaraj 等人55设计了一种简易而直接的固定寡核苷酸表面阵列的方法，他们将带有乙烯基的寡核苷酸与金电极表面叠氮功能化的自组装单分子层作用，得到高度有序、选择性好的DNA 阵列。除了上述领域，DNA 电化学传感器的研究应用范围还在不断拓宽，例如蒋晓华等人56研究了DNA过氧化聚吡咯生物复合膜传感器，可用于检测神经递质。3展望电化学DNA 传感器的研究工作开辟了电化学与分子生物学的新领域，为生命科学的研究提供了一种全新的方

22、法，在遗传疾病诊断、病原微生物检测、转基因生物检测等方面显示了广泛的应用前景。目前，尤其在国内还处于起步阶段，电1期 毛斌等:DNA 电化学生物传感器的原理与研究进展 15 36 Millan K M ,Mikkelsen S R.Voltammetric DNA Biosensor for Cystic Fibrosis Based on a Modified Carbon Paste Electrode J . Anal. Chem., 1994 ,66 (18 : 2 9432 948. 37 Wang J , Rivas G , Cai X M , et al. Detection o

23、f clinically relevant point mutations by a novel piezoelectric biosensor J . Biosens. Bioelectron ., 2006 , 21 (10 : 1 876 1 879. 38 Wang J. "PNA Biosensors for Nucleic Acid Detection " in PNA Protocols and Applications,(P. Nielsen, Ed. ,Horizon Scientific Press ,1999. 39 孙星炎,徐春,刘 盛 辉 ,等 .

24、DNA 电 化 学 传 感 器 在 DNA 损 伤 研 究 中 的 应 用 J . 高 等 学 校 化 学 学 报 , 1998, 19 (9 :1 3931 396. 47 Brett A O ,Silva L D.A DNA -electrochemical biosensor for screening environmental damage caused by s-triazine derivatives J . Anal. Bioanal. Chem.,2002 ,373 (8 : 717723. 48 Wang J , Rivas G , Cai X H. Screen -pri

25、nted electrochemical hybridization biosensor for the detection of DNA sequence from the Escherichia coli.pathogen J . Electroanalysis ,1997 ,9 (5 :395398. 49 Wang J ,Cai X H ,Rivas G ,et al.DNA electrochemical biosensor for the detection of short DNA sequences related to the human immunodeficiency v

26、irus J . Anal. Chem.,1996 ,68 (15 :2 6292 634. 50 Wang J , Rivas G , Cai X H , et al. Sequence -specific electrochemical biosensing of M. tuberculosis DNA J . Anal. Chim. Acta.,1997 ,337 (1 :4148. 51 干 宁 ,王 志 颖 ,徐 伟 民 ,等 .DNA 电 化 学 生 物 传 感 器 测 定 水 中 痕 量 铅 J . 广 东 微 量 元 素 科 学 ,2007 ,14 (1 : 40 Wang J

27、 , Musameh M , Lin Y. Solubilization of carbon nanotubes by nafion toward the preparation of amperometric biosensors J . J. Am. Chem. Soc.,2003 ,125 (9 : 2 4082 409. 41 Brett A M O ,Seqlano S H P ,Macedo T A ,et al. Electrochemical determination of carboplatin in serum using a DNAmodified glassy car

28、bon electrode J . Electroanalysis, 1996, 8 (11 :992995. 42 Ovádeková R ,Jantová S ,Leta觢iová S ,et al. Nanostructured electrochemical DNA biosensors for detection of the effect of berberine on DNA from cancer cells J . Anal. Bioanal. Chem. ,2006 ,386 :2 0552 062. 43 Kerman K ,Mor

29、ita Y ,Takamura Y ,et al. Anal.Bioanal. Chem.,2005 ,381 (6 :1 1141 121. 44 Gu K ,Zhu J ,Zhu Y, et al.Voltammetric determination of mifepristone at a DNA -modified carbon paste electrode J . Fresenius J. Anal. Chem.,2000 ,368 (8 :832835. 45 Wang J ,Chicharro M ,Rivas G ,et a1.Narasalah Dontha Percio A M Farias and Haruki Shirashi Anal J . Anal. Chem ,1996, 68 (13 :2 2512 254. 4