细菌偶氮还原研究进展

1、应用与环境生物学报2005,11(5:642647C h in J A ppl Environ B iol=ISSN10062687X2005210225细菌偶氮还原研究进展3洪义国1,2,3许玫英1,2,3郭俊2岑英华2孙国萍233(1中国科学院华南植物园广州510650(2广东省微生物研究所,3广东省菌种保藏与应用重点实验室广州510070摘要细菌偶氮还原是在细菌偶氮还原酶作用下偶氮复合物分解为芳香氨的过程,多种细菌都具有偶氮还原功能.关键词偶氮还原;偶氮还原酶;细菌;偶氮染料;氧化还原中间体CLCX172AD VANCE I N BACTER I AL AZO RED UCT I O N

2、 RESEARCH3HONG Yiguo1,2,3,XU Meiying1,2,3,G UO Jun2,CE N Yinghua2&S UN Guop ing233(1South China Institute of B otany,Chinese Acade m y of Sciences,Guangzhou510650,China(2Guangdong Institute of M icrobiology,3Guangdong P rovincial Key L aboratory of M icrobial Culture Collection and A pplication,

3、Guangzhou510070,China AbstractBacterial azoreducti on is a p r ocess that azo dyes are decomposed int o ar omatic a m ines by the azoreductase fr om bac2 teria.M any kinds of bacteria have the ability of reducing azo dyes.Under aer obic conditi on,bacterial azoreducti on was carried out by s pecial

4、azoreductase,which was not sensitive t o oxygen.But under anaer obic conditi on,bacterial azoreducti on was an uns pecific p r ocess.I n this syste m,azo dyes were catalyzed extracellularly by the redox mediat or compounds,which were either secreted during the metabolis m of certain substrates by th

5、e bacteria the m selves or added exogenously.These mediat ors could transfer redox equivalents fr om the cellme mbrane of the bacteria t o azo dyes.The acti on bet w een azo compounds and redox me2 diat or was a pure che m ical redox reacti on.Moreover,bacterial azoreducti on occurred mainly under a

6、naer obic conditi on.Gener2 ally,bacterial azoreducti on was app lied f or the aer obic/anaer obic treat m ents of dye-containing wastewaters and the research of azo poly meric hydr ogels f or col on targeted drug delivery.Fig2,Tab1,Ref45Keywordsazoreducti on;azoreductase;bacteriu m;azo dye;redox me

7、diat orCLCX172面对被偶氮染料污染的生态环境问题,人们积极探索用各种方法去解决,其中生物降解法是最有效的方法.偶氮染料脱色降解的第一步也是最关键的一步就是偶氮染料的还原,即偶氮键打开生成芳香胺的过程.对偶氮还原的深入研究,将有助收稿日期:2004208230接受日期:20042092133国家863项目(2001AA214111,广东省科技攻关项目(2002C31605和广东省自然科学基金项目(032319资助Suppor2 ted by the State Pr ogra m for H igh Technol ogy Research and Devel opment of C

8、hina,Guangdong Pr ovincial Pr ogra m f or Science and Technol ogy De2 vel opment and Guangdong Pr ovincial Natural Science Foundati on1偶氮染料概述偶氮染料是人工合成的偶氮化合物,其分子的主要特征是含有一个或多个偶氮键(-N=N-.在众多的合成染料里,偶氮染料因其产量和品种的繁多堪称是最重要的,在生产领域广泛运用的一些直接染料、活性染料、酸性染料、分散染料和金属络合染料等,都含有偶氮结构.1876年,W iff提出染料发色团说,认为染料颜色是由双键共扼体系(-N

9、=N-引起的,这些含双键的基团即为发色团.现代理论认为,染料的颜色与其结构有密切相关,共轭双键的长度,共轭体系两端的氨基、羟基、甲基和磺酸基等极性基团,分子的离子化,分子平面性,染料内络合物等会对染料颜色都会产生影响,当光线射入后发生选择性吸收而导致产生出视觉所感受到的各种颜色1.大约有2000种不同的偶氮染料广泛用于纺织品、皮革、纸张、塑料、化妆品和食物染色.目前世界染料年产量约为8×1059×105t,美国年产量约为9×104t,我国染料年产量达1.5×105t,其中50%以上是偶氮染料.在染料的生产和使用中,约有10%15%的染料随废水排入环境水体

10、,对全球的生态环境造成影响,威胁生物多样性,因此染料污染是一个全球的生态环境问题.加之偶氮染料的前体及其降解产物的致癌、致畸、致突变的“三致”作用,因此在对染料降解和脱色的研究中,偶氮染料备受重视.偶氮染料本身对人类不会产生有害的影响,其毒性主要是降解产物芳香氨,但并不是所有的偶氮染料都会产生有生物毒性的芳香胺.研究发现,只有化学结构中含有联苯胺或苯二胺的偶氮染料,才有此特性.目前全球市场中以联苯胺为基体的偶氮染料有200多种,常用的有90多种.偶氮染料在有氧的状态下不易矿化分解,在厌氧状态下则很容易被微生物分解还原为芳香胺产物,此作用称为偶氮还原.芳香胺无色无臭,在环境中不容易分解矿化,会影

11、响接触者健康;芳香胺被代谢活化成为活泼的亲电子代谢物,这些代谢物再与DNA结合成为DNA加合物,DNA加合物会造成基因中的碱基的改变,如果DNA的修复工作没做好,就会因DNA 碱基的改变而突变.资料表明,与偶氮染料打交道的人患膀胱癌的风险越来越大,这主要是进入人体的偶氮染料被肠道细菌还原,产生致癌芳香胺2.芳香胺除了会诱发膀胱癌外,也会诱发人的胃、肾脏、神经系统、口腔、咽喉、食道、肝脏、胆囊、胆管和胰脏肿瘤.同样,有毒芳香胺也诱发实验动物的各种肿瘤.这些芳香胺也有可能诱发自身免疫性疾病,例如狼疮3.2偶氮染料脱色菌的多样性对于染料脱色菌的研究,国内外文献报道的大部分是偶氮类染料的脱色研究.偶氮

12、染料脱色菌种类多样,有好氧性细菌,也有厌氧性细菌,同时还有兼性厌氧菌.其中以假单胞菌、芽孢杆菌和肠杆菌数量最多.2.1好氧性和兼氧性偶氮染料脱色菌早在1977年,Horitsu4分离出可以降解偶氮染料的细菌B acillus subtilis I F O3002.瑞士的Kulla5等人从含有磺酸基和羧基的偶氮染料橙黄I和橙黄II的环境中经过长期富集培养分离,得到两株假单胞菌K22和KF46,同时进一步研究了两菌株对染料的代谢途径.Hu等人6发现的菌株浅黄假单胞菌(Pseudo m onas luteola在完全静止或完全摇动的条件下均不降解染料,但在两天摇动两天静止的条件下对染料RedG、RB

13、B、RP2B和V2RP的降解效果分别可达37.4%、93.2%、92.4%和88%,水中含氮量对降解效果没有影响.Chen7和Chang8等对一株浅黄假单胞菌(P.luteola偶氮染料脱色率与还原产物毒性的关系以及脱色动力学做了进一步研究,得出结论:脱色并不是与生长相关联的,而是与代谢相关的. Wong9等人分离得到一种可以降解甲基红的克雷伯氏菌(Klebsiella pseum onine RS-12,研究发现,该菌无论在静止条件还是在摇动条件下均对甲基红有非常好的降解效果,加入葡萄糖或硫酸氨可以促进降解,但加入乙醇没有促进效果.Suzuli 等10从土壤沉积物中分离到3株具有偶氮染料还原

14、的好氧性芽孢杆菌(B acillus s p.OY122,黄单胞菌(Xantho m onas s p.NR2522和假单胞菌(Pseudo m onas s p.PR4121,它们都能够催化甲基红的还原.徐文东等11从处理毛纺厂染料废水活性污泥中分离得到1株高效降解菌,经鉴定,该菌为嗜热鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium thalpopilum,5d内对派拉丁蓝RRN的脱色率为34%.许玫英等12对9株染料脱色菌的脱色特性及其质粒的携带情况进行了初步研究,测定和比较了这9株细菌的16S r DNA序列,并对其进行分子鉴定和分类,经检测的9株细菌均属于肠杆菌科,其中脱色能力较广谱的5

15、株细菌均未检测到质粒的存在,它们在系统分类地位上基本上聚为一类,与埃希氏菌属的大肠埃希氏菌具有较高的同源性.葡萄牙的M ai2 er13分离到一株碱性热稳定的具偶氮还原活性的细菌(B acil2 lus s p.SF,能够在高温下还原偶氮染料.2.2厌氧性偶氮染料脱色菌刘志培等14从活性污泥中分离到几株具有反硝化能力的偶氮染料脱色菌,它们在合成培养基中能使大多数所试偶氮染料脱色,而在反硝化条件下很难使偶氮染料脱色.贾省芬15研究了专性厌氧菌硫酸盐还原菌混合培养物对偶氮染料、三苯甲烷染料、蒽醌染料的脱色作用.在菌的生长过程中,随着硫化氢的形成,染料的脱色率不断增加.另外在人的肠道中分离到了具偶氮

16、还原活性的厌氧细菌有产气夹膜梭菌(C lostridium per2 fringens和肠道粪球菌(Enterococcus faecalis16.2.3能以偶氮染料为唯一碳源和能源的脱色菌Overney17最先研究了以偶氮染料为唯一碳源和能源的脱色菌,分离到在有氧情况下以4,42乙二酸偶氮苯生长的黄杆菌(Flavobacterium.B lu mel18分离到菌株S5在有氧条件下能以偶氮复合物42羧基242磺酸基偶氮苯(CS AB作唯一碳源和能源生长,由偶氮还原酶先打开偶氮键,然后再将还原产物完全降解,并产生能量.梁沈平19等分离到Pse4、Pse29两菌,在非固定化条件下,分别对10mg/

17、L阳离子桃红FG、活性艳红K22BP溶液在染料为唯一碳源、能源时,12d脱色80%以上,这两株菌都属于假单胞菌属.2.4具偶氮染料脱色能力的光合细菌张波等20系统地研究了光合细菌(Rhodobacter sphacroides 17023对活性艳红X23B的脱色条件,并对其脱色与质粒的关系进行了研究.结果表明,光合细菌对活性艳红X23B具有良好的脱色能力,其脱色效率受其培养条件的影响较大.黄志勇等21从印染厂污泥中分离到1株沼泽红假单胞菌(Rhodopseudo m onas palustris H3,在光照厌氧条件下该菌生长细胞可将100mg/L酸性红B2G L染料去除到30mg/L.完整细

18、胞脱色的最适条件为pH710,温度30,细胞浓度2025mg/mL(湿重.低浓度的阳离子对脱色影响不大,在通氩气使严格厌氧和加有还原性辅酶I(NADH的条件下,无细胞提取液的脱色活性最高,比活率为1.154×102mg mg(p r otein-1h-1.根据降解产物的分析,推断了该菌对酸性红染料的降解代谢途径.Zhou22分离到一株光合红细菌(Rhodobacter sphaeroides AS1.1737能降解几种偶氮染料,在24h内脱色率达90%(200mg/L.尽管已筛选到的脱色菌种类较多,但单菌株适应性有限,脱色的染料种类单一.即使是对多种染料有良好脱色性能的菌株,其脱色能

19、力很不一致.而染色废水成分复杂,因此影响菌种降解效率.混合菌种在这方面有其优势,许多细菌之间存在协3465期洪义国等:细菌偶氮还原研究进展同降解作用,增加了降解效果.国内对混合菌的研究相对较多.曾丽璇等人在实际废水处理设备中分离出了几株优势菌株,发现混合菌群的脱色能力优于单菌株,且脱色时间短,适应范围广,耐冲击性能更强.本实验室分离到1株具有染料降解能力的希瓦氏菌新菌种23,命名为脱色希瓦氏菌She w anella decolorationis S12T瓦氏菌S12T偶氮染料还原机理及与Fe(还原关系的探究,将为开发有效的在呼吸链水平上以调控Fe(还原为基础的偶氮染料降解全新工艺打下基础,为

20、人类更合理利用自然资源和进行环境修复提供理论依据.3细菌偶氮还原机理偶氮染料降解的第一步也是最关键的一步就是偶氮键的打开,生成芳香氨化合物.这一步是由一类还原酶催化完成的,这类种酶叫偶氮还原酶(azoreductase.在有氧条件下,偶氮还原是由特异性的偶氮还原酶直接催化完成;在厌氧条件下,这一反应通常是由非特异性的还原酶催化一类氧化还原中间体,再由此还原了的氧化还原中间体还原偶氮键.3.1有氧条件下的细菌偶氮还原机理对于在有氧条件下的细菌偶氮还原,现在基本认为是由特异性的酶催化完成的.这些偶氮还原酶,在有氧条件下,都能降解多种偶氮染料,但每一种酶对染料的特异性是不同的.最早纯化的偶氮还原酶是

21、由羧基橙降解菌株K22产生的O range I偶氮还原酶和菌株KF46产生的O range II偶氮还原酶,这两个偶氮还原酶都是单体非黄素依赖的还原酶,NADPH是酶最适辅助因子.O range II偶氮还原酶严格要求偶氮键的位上为羟基基团,而O range I偶氮还原酶要求在偶氮键的位上为羟基基团24,25.到目前为止,仅有6个在有氧条件下作用的偶氮还原酶被纯化、特征分析并得到其基因序列(表1.从表中可以看出,这些酶都有一个NAD(PH结合位点,表明都以NAD(PH作为辅酶,但对NADH和NADPH的Km值有很大的不同.另外,Escherichia coli与Enterococcus fae

22、calis偶氮还原酶是F MN 依赖的NADH偶氮还原酶.大连理工大学的Yan36用PCR的方法从类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides AS1.1737克隆到偶氮还原酶基因,并在大肠杆菌中表达纯化,用纯化酶研究了偶氮还原过程中羟基化偶氮中间体的存在,为偶氮染料还原必须通过一个非完全的的还原过渡阶段提供了理论依据(图1.表1有氧条件下作用的偶氮还原酶Table1Azoreductases acting under aer obic conditi on6Enterococcus faecalis23000208F MN2dependent aer obic az oredu

23、ctase,is oelectric point4.830 图1偶氮还原酶作用机制Fig.1Mechanis m of az oreducti on by az oreductase目前已经得到的6个偶氮还原酶基因,序列分析表明,几种酶基因之间没有显著的同源性.这表明,这几个蛋白是按不同的方式进化为具偶氮还原活性的酶,偶氮还原酶的进化很可能是趋同进化的结果.同时也表明,有氧状态下偶氮复合物的降解并没有被偶氮键的代谢所限制.另外,在有氧条件下,很多好氧菌在含有复杂化合物的培养基中摇动培养,虽然菌体大量生长但并不表现很好的脱色特性.当把培养的细菌细胞放置以后,却有很好的脱色效果.在静置状态下,菌体

24、可能快速消耗了液体中的氧,偶氮还原是在厌氧状态下进行的.所以这类细菌的偶氮还原是好氧生长、厌氧还原,与上面论述的好氧偶氮还原酶的作用机理是不同的.有关厌氧偶氮还原机理将在下面讨论.3.2厌氧偶氮还原机理446应用与环境生物学报C h in J A ppl Environ B iol11卷与偶氮染料竞争还原型电子载体.在偶氮染料与还原型电子载体之间自发发生的反应是非特异性的还原过程,反应的发生是由氧化还原中间体和偶氮复合物的氧化还原电势来决定的.近来的研究表明,氧化还原电势(E 0大约在-320mV 到-50mV 之间的醌类氧化还原中间体通常都能在细菌厌氧偶氮还原中发挥有效的功能.这一限度是由细

25、胞氧化还原辅助因子NAD (P H 的氧化还原电势和偶氮复合物的氧化还原电势(-180mV -430mV 共同决定的31 .图2厌氧条件下依赖氧化还原中间体的偶氮还原机制Fig .2Pr oposed mechanis m f or redox mediat or dependent reducti on of az o dyes under anaer obic conditi on对嗜热鞘氨醇杆菌S.xenophaga BN6菌偶氮还原酶的定位实验表明,细胞中存在两套偶氮还原酶系统.一套是位于胞质中的黄素氧化还原酶;另外一套是位于细胞膜上的与呼吸链有关的NADH:泛醌氧化还原酶.AQS 能

26、显著提高细胞的厌氧偶氮还原率,但对胞质抽提物却影响不大.早期的研究表明,胞质黄素还原酶催化产生的还原型黄素在兼性厌氧菌的非特异性的偶氮还原过程中发挥重要作用32.近来,在不同的菌株中重组表达黄素还原酶,充分证明了黄素还原酶具有偶氮还原酶活性.胞质黄素还原酶在完整细胞的厌氧偶氮还原中可能发挥较小的作用,因为极性偶氮染料不易透过细胞膜进入细胞内部.在静置的重组黄素还原酶基因(fre 的菌体细胞中添加F AD,对偶氮还原影响很小,而向其细胞裂解物中添加F AD时,却能显著提高其偶氮还原率33.xenophaga BN6菌体细胞的酶催化还原,还原型的醌在还原偶氮复合物,这是一个纯化学氧化还原过程.细胞

27、裂解实验表明,醌氧化还原酶活性定位在细胞膜上32.在研究菌株S.xenophaga BN6的萘磺酸(naphthalenesulfo 2nic acid 降解途径时,得到另外一个不同的厌氧偶氮还原模型.在好氧条件下萘磺酸降解产生水杨酸盐(salicylate ,水杨酸盐在S.xenophaga BN6的厌氧偶氮还原中做为氧化还原中间体起到重要作用.水杨酸的还原可能是由与呼吸链相关的NADH:泛醌氧化还原酶催化的,它作为一穿梭体不断的把胞内的还原力带到胞外还原偶氮复合物.这个实验表明,这种在细胞的代谢中形成的氧化还原中间体在环境污染物的降解中起到重要作用,可以用来发展好氧-厌氧生物降解反应器34

28、.在厌氧培养的大肠杆菌中添加la ws one 能显著提高对不同的磺基化的偶氮复合物还原率.进一步研究在胞质中发现了一种NADH 依赖的la ws one 还原酶,分析表明,NADH 依赖的la w 2s one 还原酶就是氧不敏感的硝酸还原酶Nfs B.另外,对硝酸还原酶Nfs A 的研究表明,此酶也具有la ws one 还原酶活性35.细胞分离实验表明,la ws one 还原酶活性几乎完全存在于胞质部分,膜部分只有5%的酶活性.Nfs A 和Nfs B 突变株与野生型相比,仅表现5%的la ws one 还原酶活性.作者推测更可能的是la ws one 和它的还原形式原力从胞内带到胞外

29、.la ws one 作为一个适合的氧化还原中间体不仅仅因为它的氧化还原电势,而且通过菌体细胞膜扩散,而不是偶氮复合物的的跨膜扩散.这样,这些氧化还原中间体复合物就能把就能把还原力从胞内带到胞外.la ws one 作为一个适合的氧化还原中间体不仅仅因为它的氧化还原电势,而且因为它的具好的脂溶性.在其他细菌中也存在与Nfs A 和Nfs B 功能相似的酶,这些酶也有可能与Nfs A 和Nfs B 一样,在厌氧条件下作为la ws one 依赖的偶氮还原酶.另外在研究严格厌氧肠道菌过程中,得到一个不同的厌氧偶氮还原模型,在这个模型中也不要求偶氮染料的跨膜转运.C lostridium perfr

30、ingens 菌体培养基的上清液中仍然有偶氮还原酶活性,表明菌体分泌了一类胞外的偶氮还原酶36,37.对其分泌的胞外偶氮还原酶分析,结果发现其活性与黄素无关,且能被氧气快速抑制.对这类酶的作用机制研究较少.最近的研究表明,硫细菌在厌氧呼吸中产生的H 2S 能导致偶氮染料Reactive O range 96的有效还原.在环境中,Fe 2+、H 2S 这样的还原库在偶氮染料的降解中可能起到重要作用.NADH 作为一个纯化学还原剂在偶氮染料的还原中也被探讨.NADH 通过转移4个电子还原多种偶氮染料,还原反应具很强的pH 依赖性,随着pH 的下降还原增强38.综上所述,细菌在厌氧条件下发生的偶氮还

31、原是在非特异性还原酶作用下的电子传递过程.偶氮复合物作为末端电子受体,接受从电子氧化还原中间体传来的电子而被还原.通过上面的分析,我们推测,偶氮复合物可能在细菌的厌氧呼吸过程中作为末端电子受体接受电子而被还原,所以厌氧偶氮还原过程也是厌氧偶氮呼吸过程,细菌可能在这一过程中获得生长所需的能量.对这一问题的研究具有重要的理论和实践意义,我们实验室正致力于此方面的研究.5465期洪义国等:细菌偶氮还原研究进展4细菌偶氮染料还原的应用研究基于对细菌偶氮还原的基础研究,人们也积极致力于其在应用领域的研究.目前细菌偶氮还原主要应用于两个研究领域:一个是染料废水处理系统的应用,另一个就是偶氮聚合物作为结肠靶

32、向给药载体的研究.4.1厌氧-好氧染料废水的处理系统通过大量的实验表明,染料的脱色反应(偶氮键的断裂主要是在厌氧条件下进行.因为厌氧偶氮还原是在一些氧化还原中间体作用下的非特异性的反应,所以厌氧偶氮还原更适于含有多种染料的废水的前期处理.厌氧偶氮还原的结果是虽然废水被脱色,但却产生了多种芳香氨类有毒化合物,这些化合物往往在厌氧条件下难于进一步被降解.这些在厌氧条件下产生的对人及环境有毒害甚至致癌作用的芳香胺类中间产物,在好氧条件下易被降解.基于以上的研究结果,对染料脱色的工艺流程一般为厌氧-好氧串联操作,最终达到去除色度,降低COD的目的,使出水达标39.厌氧-好氧染料废水的处理策略最先用于磺

33、基化偶氮染料Mordant Yell ow3的脱色研究40.近几年来,发展了多种不同的厌氧-好氧染料废水的处理系统,如厌氧-好氧接触生物反应器,厌氧膜固定流体床-好氧悬浮床活性污泥反应器,厌氧-好氧旋转鼓反应器.近来,已报道了几个利用醌从菌体细胞中转运还原力到胞外还原多种天然或人工合成的复合物,如铁离子、硝基芳香化合物、多聚卤代化合物41,42.象Nfs A和Nfs B这样的酶也许参与了环境中的多种污染物的还原降解.我们也可以调控这些酶的活性,加快环境中偶氮污染物的降解.在研究菌株S.xenophaga BN6的萘磺酸(naphthalenesulfo2 nic acid降解途径时,发现产生的

34、氧化还原中间体水杨酸盐在其厌氧偶氮还原中做为氧化还原中间物起到重要作用34.我们可以调控萘磺酸类的细菌代谢途径,发展可控的好氧-厌氧生物降解反应器.4.2偶氮交联聚合物作为结肠靶向给药载体的研究5研究展望细菌偶氮还原研究涉及生物能学和环境污染等基本问题,且与资源利用、环境修复等重要社会实践相关,拓宽并深化此类研究具有一定意义.未来的研究应重点解决如下问题:(1细菌厌氧偶氮还原机理的研究;(2细菌偶氮还原系统蛋白系统的定位;(3偶氮键作为末端电子受体是否支持细菌的的厌氧呼吸;(4氧化还原中间体在偶氮还原过程的的作用;(5拓宽细菌偶氮还原应用研究.References1Hao LJ(郝鲁江,Xu

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