神经原纤维Bodian染色法的改良

1、    神经原纤维Bodian 染色法的改良        Bodian 染色法1于1936年首创，是一种用于观察神经元、轴突和树突内神经原纤维变化的浸银染色法。基本原理是把甲醛固定后的石蜡切片浸于银溶液中，再用还原液处理后，使银颗粒沉积于神经纤维上呈现为棕色或棕黑色。传统染色液的配制是在蛋白银溶液内放入金属铜。但此方法存在着以下几个缺陷：(1)背景色深，血管和胶原纤维有共染现象，影响对神经纤维的观察。(2)染色时间难于掌握。(3)容易脱片。我们对经典Bodian染

2、色法进行了改良，建立了一种去铜改良型Bodian染色法，并对其应用进行了探索。 一、材料与染色步骤1病例与材料：我院于19931998年临床病理学确诊为阿尔茨海默病3例（男性1例，女性2例），多系统萎缩症1例（男性），肌萎缩侧索硬化症1例（女性）和非神经系统疾病死亡病人1例（女性）。分别取大脑颞叶海马、基底核、中脑、桥脑、小脑和第7颈髓。4甲醛固定、常规脱水、透明、石蜡包埋，切片厚8 m。2染色试剂及配制：（1）蛋白银溶液配制：1蛋白银（购自德国Merck KGaA公司）溶液100 ml内加入10乙酸水溶液0.7 ml充分搅拌过滤后再加入0.5氢氧化钠水溶液0.33 ml，调整pH值在6 左右

3、。（2）还原液配制：1对苯二酚水溶液100 ml内加入无水硫酸钠4 g搅拌后一次性使用。（3）0.5氯化金水溶液。（4）2草酸水溶液一次性使用。3染色步骤：（1）常规脱蜡，水洗和双蒸馏水清洗。（2）1蛋白银溶液内浸银，60隔水恒温箱内孵育18 h。（3）室温冷却。（4）双蒸馏水清洗4次（时间控制在1 min以内）。（5）在还原液中还原15 min。（6）流水洗3 min，再用双蒸馏水清洗。（7）0.5氯化金水溶液浸泡40 min。（8）流水洗3 min，再用双蒸馏水清洗。（9）2草酸水溶液浸泡20 min。（10）流水洗5 min，再用双蒸馏水清洗。（11）5硫代硫酸钠水溶液浸泡3 min。（

4、12）流水洗5 min，再用双蒸馏水清洗。（13）乙醇脱水、透明、封固。二、结果1.神经原纤维、轴突和树突呈棕色或棕黑色。背景、血管和胶原组织呈浅咖啡色。2.在3例阿尔茨海默病中均发现有神经原纤维缠结和老年斑沉积。本染色方法能清晰地显示神经原纤维缠结的形态学特征。在大脑皮质颞叶海马区锥体神经细胞层内表现为束状，在中脑动眼神经核神经细胞内表现为球状（1，2）。在大脑皮质深层可见棕黑色淀粉样核心斑块，周围由变性轴突或树突围绕成环状的经典型老年斑，在大脑皮质浅层可见变性轴突或树突围绕成环状而缺乏淀粉样核心斑块的弥漫型老年斑（3，4）。神经原纤维缠结和老年斑广泛分布于颞叶海马区、嗅皮质、杏仁核和额顶叶

5、皮质。在基底核、中脑、桥脑和小脑皮质处也发现有神经原纤维缠结和老年斑沉积。3.在多系统萎缩症中，本染色方法能清晰地显示在少枝胶质细胞胞体内有染成淡棕色火焰样包含体（glial cytoplasmic inclusion）存在（5）。广泛分布于大脑基底核、内囊、中脑黑质、桥脑核、延髓橄榄核、小脑白质和脊髓白质。4.正常脊髓横断面脊髓侧索，本染色能清晰地显示粗细两种类型神经纤维排列，而在肌萎缩侧索硬化症的病例中可见脊髓侧索内粗大神经纤维有选择性地明显脱落（6，7）。三、讨论经典Bodian染色法存在着背景色深，血管和胶原纤维有共染现象等缺陷。去铜改良型Bodian染色法，使阳性产物显示清晰，背景干

6、净，抑制了血管和胶原纤维共染现象。在阿尔茨海默病的研究中，对神经原纤维缠结和老年斑的形态学观察常用的染色法有Bodian浸银染色法、Bielschowsky浸银染色法、Tau蛋白、-amyloid蛋白免疫组织化学和Thioflavin S荧光法。但Bielschowsky浸银染色法存在着操作繁琐、着色不稳定、特异性差、背景色深等缺陷。免疫组织化学不能在同一张切片上清楚地观察神经原纤维缠结和老年斑之间的关系，放置时间过久会退色。Thioflavin S荧光法需有特殊滤片，还需在荧光显微镜下观察，在一般实验室难于开展。相比之下去铜改良型Bodian染色法更具有实用性和敏感性。能在同一张切片上清楚地

7、观察神经原纤维缠结和老年斑之间的关系，并发现神经原纤维缠结和老年斑在不同的部位有不同的形态学特征。在多系统萎缩症中，近年来有文献报道应用泛素蛋白(ubiquitin)和共核蛋白(-synuclein)免疫组织化学分析，发现在少枝胶质细胞内有包含体存在。但背景色深，标记阳性物质放置时间过久会退色。而去铜改良型Bodian染色法能清楚地显示少枝胶质细胞内包含体，并广泛分布于中枢神经系统各部位2。在肌萎缩侧索硬化症中，发现脊髓侧索病变以粗神经纤维脱落为主。因此去铜改良型Bodian染色法便于观察病变的形态学特征，损害程度和分布情况，并在研究中可用于定量测定和分析。1海马锥体细胞内束状神经原纤维缠结&

8、#215;4002中脑动眼神经核神经细胞内球状神经原纤维缠结×4003大脑皮质深层经典型老年斑×4004大脑皮质浅层弥散型老年斑×4005小脑白质少枝胶质细胞胞体内包含体×4006正常脊髓侧索粗大神经纤维×2007肌萎缩侧索硬化症的脊髓侧索粗大神经纤维脱落伴淀粉样小体增多×200 （17均为去铜Bodian 染色法）在配制蛋白银溶液时控制pH值尤为重要。中枢神经系统标本染色时pH值控制在6为佳，周围神经系统标本pH值控制在5为宜。还原液和草酸水溶液需现配现用。在具体操作过程中待蛋白银溶液在室温中完全冷却后，在双蒸馏水内清洗4次，时间应

9、严格控制在1 min以内。这样可抑制背景色和避免脱片。总之，去铜改良型Bodian染色法具有操作简单、易于掌握、着色稳定、特异性强、背景干净、可永久保存等长处。在神经系统疾病的诊断和研究中具有重要价值，值得推荐。作者单位：汪寅（复旦大学医学院神经病学研究所，上海，200040）张玉林（复旦大学医学院神经病学研究所，上海，200040）张福林（复旦大学医学院神经病学研究所，上海，200040）吕传真（复旦大学医学院神经病学研究所，上海，200040）叶诸榕（病理学教研室）参考文献1，Bodian D. A new method for staining nerve fibers and nerve ending in mounted paraffin section. Anat Rec, 1936, 65: 89-97