稀有放线菌质粒生物学的研究进展

1、稀有放线菌质粒生物学的研究进展         09-08-27 14:41:00     编辑：studa20                        作者：田永强 赵国屏 覃重军【摘要】  非链霉菌属的稀有放线菌类群广泛分布在自然

2、环境中，具有重要的基础研究与应用价值。在许多稀有放线菌中发现了环型与线型质粒，由质粒发展起来的遗传操作系统可以为研究稀有放线菌的生理及代谢提供强有力的工具。本文综述目前稀有放线菌中的质粒生物学的研究进展。 【关键词】  稀有放线菌； 质粒    ABSTRACT  The non-Streptomyces actinomycetes, living widespread in various habitats, are important for the basic and applied researches purposes. They h

3、arbor indigenously circular as well as linear plasmids, a useful source for developing genetic tool for studying of their unique physiology and metabolism. In this review, we summarize the current progresses on plasmid biology in the rare actinomycetes.    KEY WORDS  Rare actinom

4、ycetes;  Plasmid    放线菌类群是十分重要的高G+C含量的革兰阳性细菌，它们的培养形态与细菌有本质区别，大多数产生菌丝结构，包括培养基中的基质菌丝和培养基表面的气生菌丝及孢子丝。迄今已发表145个属，约2000个种，其中链霉菌属中约500个种。它们产生了大约10000种抗生素和生理活性物质，在医药、工业和农业方面具有重要的应用价值1。非链霉菌属的稀有放线菌广泛分布于各种土壤环境中，常具有独特的形态及生理特点。稀有放线菌也象链霉菌一样能够产生丰富的次生代谢产物，如拟无枝菌酸菌产生的利福霉素(rifamycin)及万古霉素(vancomyc

5、in)2，游动放线菌产生的替考拉宁(teicoplanin)3等在临床上是极为重要的抗生素。此外，许多稀有放线菌属在农业、环保和医学方面具有重要的意义，如可以进行生物固氮的弗兰克菌，具有降解有毒害化合物功能的红球菌，导致人类麻风病和结核病的分枝杆菌等4。过去几十年里，放线菌的遗传学研究主要集中在链霉菌属，对放线菌其它类群的遗传学研究相对较少，尤其是对它们的遗传操作体系则更少。对稀有放线菌属的生理或病理的研究迫切需要分子操作工具，所以发展稀有放线菌的遗传操作就有非常现实的意义。本文综述非链霉菌属的放线菌质粒生物学及其遗传操作体系的研究进展。    1  稀

6、有放线菌中的质粒研究现状    1.1  分枝杆菌质粒    除环型质粒外，Picardeau等报道了在M.xenopi、M.branderi、M.celatum type 2和M.celatum type 3等菌株中发现14个线型质粒，大小从20kb到320kb，通过Southern blotting分析可以将它们分为不同的类群，同类群的质粒是不相容的15。Picardeau等对M.celatum来源的25kb线型质粒pCLP进行了分析，发现它具有与其它放线菌线型质粒相似的端粒结构16。同时它们对质粒pCLP的复制区功能进

7、行了测定，复制区有两个ORF，分别编码复制和分配蛋白，其间有一小段与分枝杆菌环型质粒复制起始区相似的序列，推测其为线型质粒的复制起始区。用该复制区构建的载体pCL4D与M.fortuitum来源的环型质粒pAL5000和pJAZ38具有相容性。    1.2  棒状杆菌质粒    棒状杆菌由非致病的土壤类群(Corynebacterium glutamicum，C.callunae，Brevibacterium lactofermentum)、动物致病类群(C.diphtheriae，C.xerosis)和植物致病类群(C.

8、nebraskense，C.michiganense)组成。非致病的土壤棒状杆菌在工业上主要用于生产氨基酸，另外的用途包括降解石腊(paraffin)生产去污剂及固醇转化等。从20世纪70年代末期开始，许多实验室进行了大量的筛选工作找到了许多大小分布在1.4kb到69kb之间的质粒1720。通常这些菌株的大质粒上携带有抗生素耐受性基因(表1)。    Katsumata23和Martin24分别用不同的质粒发展了棒状杆菌的克隆载体及转化系统。主要的克隆载体是由pBL1和pSR1复制子构建而来24，25。大肠埃希菌中的启动子序列与棒状杆菌的具有同源性，因此，大肠埃希

9、菌中的lac、trp、PL操纵子和PR阻遏子可以在棒状杆菌中表达，这就为构建棒状杆菌的表达载体提供了便利26，27。    1.3  诺卡菌质粒    诺卡菌作为好气的放线菌是引起人体感染的病原菌。但是对它的质粒生物学性质研究并不多。Kirby等28于1985年第一次从诺卡菌Nocardia corallina中分离到2.7kb的环型质粒pKU100。之后，诺卡菌质粒的工作停滞不前，许多诺卡菌的基因都可在链霉菌中进行表达29。Madon等利用地中海拟无枝菌酸菌(Amcolatopsis mediterranei)质粒pMAE

10、100发展出能在诺卡菌中复制的载体pMAE12330。最近Liu等31表2    棒状杆菌环型质粒复制模式在N.italica中发现环型质粒pNI100，并克隆了该质粒的复制起始区，该区域包含一个编码396个氨基酸的蛋白，与链霉菌质粒pSG5的Rep蛋白有3段同源区域，推测它可能具有与pSG5相似的滚环复制机制。该质粒可以通过转化变铅青链霉菌(S.lividans)ZX7而产生麻点(pock)现象。根据pNI100复制子发展了能在大肠埃希菌与诺卡菌穿梭的质粒pNI105，这为诺卡菌的遗传操作提供了便利。    Kalkus等32在氢自

11、养型N.opaca中发现了多个线型和环型质粒，如菌株MR11含有环型质粒pHG31-a和pHG31-b及线型质粒pHG201(270kb)、pHG202(400kb)、pHG203(420kb)，菌株MR22中环型质粒pHG33和pHG204(180kb)、pHG205(280kb)和pHG206(510kb)。用氢化酶与二磷酸核酮糖羧化酶基因作为探针进行杂交分析，在接合转移质粒pHG201与pHG205中均发现阳性信号，证实它们与氢的代谢有关。    1.4  红球菌质粒    在过去20年里，红球菌作为与环境相关的微生物

12、受到越来越多的关注。它们可以降解许多环境污染物，如酚类物质、杀虫剂、除草剂、丙烯酰胺、苯胺、卤化烷烃等有害物质3337。目前从红球菌中分离到许多环型质粒，这些质粒按复制子的类型可分为两种，其一，以theta方式复制的质粒，如pRE2895。该质粒编码RepA和RepB与ColE2型质粒的复制蛋白具有相同的特点，故推测其具有theta方式的复制机制。目前利用pRE2895的repAB构建了表达质粒pTip38。其二，以滚环方式复制的质粒，如R.erythropolis DSM8424的pRE8424。它有一个单链起始区和一个双链起始区，这是典型的滚环复制单元。对单链起始区的突变分析发现单链中间体

13、在体内积累，这是因为单链不能及时转化成双链引起的。以pRE8424复制区构建的表达质粒能与以pRE2895为基础的质粒同时存在细菌体内，表明它们属于不同的不相容群39。    对于R.aetherovorans I24(7Mb)和R.erythropolis PR4 (7Mb)的基因组研究表明红球菌体内存在n个大的线型质粒，许多与环境污染物降解有关的基因就位于线型质粒上40。如多氯联苯(PCB)的降解菌R.erythropolis RHA1包含三个线型质粒：pRHL1(1100kb)、pRHL2(450kb)和pRHL3(330kb)，PCB的降解基因bph分散在

14、染色体与质粒pRHL1和pRHL2上41。在R.erythropolis BD2线型质粒pBD2(210kb)上还发现异丙基苯的降解基因ipb和具有降解联苯功能的etbD1类似基因42。此外，催化有机硫化物脱硫的催化途径位于红球菌IGTS8的150kb的线型质粒上43，红球菌DK17具有两个线型质粒pDK1(380kb)和pDK2(330kb)，后者含有烷基苯代谢的单加氧酶与meta-环裂解的双加氧酶基因44。    1.5  弗兰克菌质粒    在弗兰克菌中已发现多个环型质粒，大小从7kb到190kb4547。目前已完成了

15、来自菌株ArI3的质粒pFQ3148和菌株CpI1的pFQ1149以及pFQ1250的测序工作。22.4kb的pFQ12有超过50个开放阅读框(ORF)，9个有转录活性50。pFQ31有17个ORF48，pFQ11有4个49，pFQ11与pFQ31有大约99.7%的同源性。在3个质粒上都发现了质粒分配蛋白基因，如pFQ31的parFA，pFQ11的ORF3编码类似假单胞菌Pseudomonas alcaligenes ParA的蛋白，pFQ12含有一个类似芽孢杆菌B.subtilis的SpoJ的ParA蛋白，这些par基因的编码产物使质粒能在子细胞中稳定存在。同时还发现与链霉菌中接合转移与整合

16、性质粒pSAM2 KorSA类似的蛋白。根据ptrFA和repFA之间的DNA结构域推测质粒pFQ31的复制起始区位于其间，该区域序列具有重复子(iteron)序列，这些结构通常在以theta方式复制质粒的复制区中存在，repFA编码复制起始蛋白Rep。pFQ12有两个开放阅读框(ORF3与ORF6)可能与质粒的转移有关。    1.6  小单孢菌质粒    1.7  拟无枝菌酸菌质粒    1.8  其它稀有放线菌的质粒    马杜拉放线菌产生

17、多种抗生素60，但是其遗传操作体系的发展却相对落后，原因在于从马杜拉菌中发现的质粒相对较少。只有Dairi等61分离得到4个质粒(pAE042、pTPA0016、pTPA0019和pTPA0123)，并利用pTPA0123的复制区构建了能在Actinoma-dura verrucosospora中稳定复制的克隆载体。Fare等62从链孢囊菌Streptosporangium brasiliense中分离到环型质粒pSgB-1，从S.viridognriseum中分离到质粒pSgV-1。Polo等63从延伸因子Tu抑制剂的产生菌玫瑰游动双孢菌(Planobispora rosea)中分离得到两个

18、线型质粒pPR1(27.5kb)和pPR1(16kb)。两个质粒具有相似的序列，但它们的端粒结构有一定的差异，pPR2端粒区域的650bp具有类似于链霉菌端粒的倒转重复序列。    2  前景展望    稀有放线菌产生的抗生素种类占所有放线菌产抗生素的三分之一62，随着对稀有放线菌环型与线型质粒被发现，越来越多的克隆或表达载体被构建，可以为深入研究稀有放线菌的遗传特征提供更多的帮助，也为有效利用微生物资源提供了有力的工具。【参考文献】  1 刘志恒，姜成林. 放线菌现代生物学与生物技术M. 北京：科学出版社，200

19、42 Yao Y, Zhang W, Jiao R, et al. Efficient isolation of total RNA from antibiotic-producing bacterium Amycolatopsis mediterranei J. J Microbiol Methods,2002,51(2):1913 Sosio M, Bianchi A, Bossi E, et al. Teicoplanin biosynthesis genes in Actinoplanes teichomyceticus J. Antonie Van Leeuwenhoek,2000,

20、78(34):3794 Cosma C L, Sherman D R, Ramakrishnan L. The secret lives of the pathogenic mycobacteria J. Annu Rev Microbiol,2003,57:6415 Crawford J T, Bates J H. Isolation of plasmids from mycobacteria J. Infect Immun,1979,24(3):9796 Jensen A G, Bennedsen J, Rosdahl V T. Plasmid profiles of Mycobacterium avium/intracellulare isolated from patients with AIDS or cervical lymphadenitis and from environmental samples J. Scand J Infect Dis,1989,21(6):6457 Labidi A, Dauguet C, Goh K S, et al.