通痹灵对类风湿关节炎滑膜细胞血管内皮生长因子mRNA的影响

1、通痹灵对类风湿关节炎滑膜细胞血管内皮生长因子mRNA的影响         11-05-06 11:43:00     编辑：studa20              作者：黄清春,储永良,接力刚,沈鹰,陈纪藩,陈光星,王捷【摘要】  目的 观察通痹灵对体外培养的类风湿关节炎(RA)滑膜细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响,

2、探讨其可能的作用机制。方法 行关节腔镜手术取RA患者膝关节滑膜组织消化分离滑膜细胞进行分组培养。空白对照组：含生理盐水10%胎牛血清的DMEM培养；通痹灵低剂量组：50 mg/L通痹灵10%胎牛血清的DMEM培养；通痹灵高剂量组：200 mg/L通痹灵10%胎牛血清的DMEM培养。提取总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组VEGF mRNA的表达。结果 通痹灵高、低剂量组VEGF mRNA表达较对照组明显降低(P0.05)。结论 通痹灵可以下调RA患者滑膜细胞VEGF mRNA表达水平,从而可以通过抑制VEGF表达减轻滑膜血管翳增殖。 【关键词】  通痹灵；类风湿关

3、节炎；滑膜细胞；血管内皮生长因子    Abstract：Objective To study effect of Tongbiling (TBL) on VEGF mRNA expression in RA synovlcytes cultured in vitro and explore its mechanism. Method Synovial cells from the knee joint in patient with RA were digested, divided and separately cultured after arthrosco

4、py. Blank controls：DMEM culture containing 10% FBS in saline；Low-dose admission group of TBL：DMEM culture containing 10% FBS in 50 mg/L TBL；High-dose admission of TBL：DMEM culture containing 10% FBS in 200 mg/L TBL. RNA were distilled. Expression of VEGF mRNA were detected with RT-PCR. Result Compar

5、ed with control group, expression of VEGF mRNA in low and high-dose admission groups of TBL both decreased (P<0.05). Conclusion Expression of VEGF mRNA can be decreased by TBL, so the proliferation of the synovial pannus can be alleviated by inhibition of VEGF expression.    Key wo

6、rds：Tongbiling；rheumatoid arthritis；synovial cell；vascular endothelial growth factor    类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以损害全身多关节特别是四肢小关节为主的慢性自身免疫性疾病,主要表现为慢性、对称性、进行性多关节炎,其典型的病理特征为炎症滑膜增生、单核细胞浸润和新生血管形成。关节滑膜的慢性炎症、增生,形成血管翳,侵犯关节,最终导致关节畸形和功能丧失。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF

7、)是最有力的血管生成因子,在RA病理过程中起着关键作用1-2。本实验就其对体外培养RA患者膝关节滑膜细胞VEGF基因水平的影响进行研究,进一步明确通痹灵对血管新生的影响。1  材料与方法1.1  主要试剂与仪器    通痹灵浸膏(由桂枝、芍药、知母、生姜、甘草、麻黄等10味中药组成,广州中医药大学热带病研究所植物化学分析室提取,每克浸膏相当于原药材3.45 g),DMEM(美国GIBCO公司生产)。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,杭州四季青公司生产),胶原酶、胰蛋白酶、焦碳酸二乙酯(diethylpyrc arbonat

8、e,DEPC,美国GIBCO公司生产),PCR marker(北京鼎国生物技术发展中心),RT-PCR通用试剂盒及-Actin引物(大连宝生物工程有限公司),Primer软件设计及VEGF基因扩增引物(赛百胜公司)。CO2恒温培养箱(德国HERAEUS公司生产),倒置相差显微镜、荧光显微镜(日本OLYMPUS公司生产),超净工作台(苏州净化设备厂生产),核酸蛋白成像仪(Pharmacia公司),核酸蛋白分析仪(Beckman公司),电泳仪及水平电泳槽(美国Bio-Rad公司),PCR仪(美国PERKIN EIMER公司),低温高速离心机(SIGMA公司),常温低速离心机(北京医用离心机厂),分

9、光光度计(Beckman公司),电转仪(美国Bio-Rad公司)。1.2  类风湿关节炎患者滑膜细胞的分离提取及培养    RA患者肿胀的膝关节行关节腔镜手术取滑膜组织。将所取标本倒入玻璃皿中,用Hanks液洗涤3次,用眼科剪反复剪碎组织约23 mm2大小,加入含10%胎牛血清的DMEM和0.2%胶原酶(终浓度为0.2%),移入75 cm2培养瓶中,37 、5%CO2培养箱中消化10 min；反复吹打后移入离心管,1 000 r/min离心10 min；弃去上清液,加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM吹打终止消化；用200目钢网过滤后1 000 r/m

10、in离心10 min,去上清液,加入含10%的DMEM 2 mL吹打均匀,移入75 cm2培养瓶中于37 、5%CO2培养箱中培养,观察细胞生长情况。生长3 d后细胞生长良好,长满培养瓶,消化分瓶,定时观察换液,长到一定数量后冻存部分细胞保证以后备用,剩余部分维持培养,取710代用于实验,每瓶待细胞长至约0.8×107时施加作用因素。空白对照组：含生理盐水10%胎牛血清的DMEM培养；通痹灵低剂量组：1.5 g/mL通痹灵10%胎牛血清的DMEM培养；通痹灵高剂量组：150 g/mL通痹灵10%胎牛血清的DMEM培养。待施加因素后培养72 h,细胞生长至107时进行裂解细胞提取总RN

11、A。1.3  总RNA提取    取培养的滑膜细胞消化离心,用PBS洗涤3次,加入0.8 mL RNAsol完全裂解细胞,转移裂解液至1.5 mL EP管中,加入80 L氯仿,水平震动10 s,冰浴5 min,40 低温离心机10 000 r/min离心20 min,吸取上清液移至另一EP管中,加入等量异丙醇完全混合后冰浴20 min,40 低温离心机10 000 r/min离心20 min,去上清液,用1 mL 75%乙醇洗涤沉淀物,小心倒去乙醇,自然风干1015 min,加入适量DEPC H2O溶解。1.4  RNA样品鉴定 &#

12、160;  电泳：取RNA样品5 L,用1%琼脂糖凝胶电泳可见3条电泳带(见图1)；吸取5 L入核酸和蛋白分析仪的吸光度测量管,测260 nm吸光度(管中另加DEPC H2O补至1 mL,等于稀释200倍)。取2 L做反转录反应。1.5  反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)    反应利用PCR扩增仪进行。RT反应合成cDNA：取5 L总RNA加热70 5 min,以破坏其二级结构；在20 L反转录反应体系中进行,1 L AMV反转录酶、2 L总RNA、2 L dNTP、4 L MgCl2、2 L 10-RT Buffer、7.5 L DEPC H2O、0.5 L RNase Inhibbtor、1 L Random 9 mers；30 反应10 min,40 反应30 min,99 变性5 min,5 5 min。PCR反应：在50 L反转录反应体系中进行,8 L cDNA、1 L VEGF引物(正、反向引物各0.5 L)、0.25 L TakaRa Ex TaqHs、10 L 5×PCR Buffer、28.75 L DEPC H2O、2 L -Actin；VEGF引