间接ELISA在检测巴氏杆菌抗体中封闭条件的选择

1、Vol. 37，N1 研究报告间接 ELISA 在检测巴氏杆菌抗体中封闭条件的选择毛东风，王康英，刘翊中，冯若飞，孙会芳，佟辉（ 西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）摘要：间接 ELISA 在检测抗体中广泛应用，而封闭作为间接 ELISA 中必不可少的一步可直接影响试验的准确性。利用巴氏杆菌提取的包被抗原，经方阵滴定法确定抗原和血清的最佳工作浓度为11 400 和 11 100。而且通过对几种封闭液分别 37C 水浴 2 h 后 4C 24 h、4C 24 h、37C 水浴 3 h 封闭对比找出最佳的封闭条件为含 0. 5% BSA 2% 蔗糖的 PBS 封闭液在 37

2、C 水浴 2 h 后 4C 24 h。关键词：间接 ELISA；包被；OD492 - 630中国图书分类号：S 852. 43 文献标识码：A 文章编号：1006799X（2007）010009039间接 ELISA 是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体检测已与固相抗原结合的受检抗体。在间接法血清中非特异性蛋白含量远超过特异性蛋白，这些非特异蛋白可以直接吸附于固相上，从而导致阴性本底值过高，使检测的准确性降低。而封闭是载体经抗原或抗体经包被后用大量的无关蛋白填补载体表面未被占据的空间。封闭和包被类似，但封闭液中蛋白含量往往较大，一般常用的封闭液为牛血清白蛋白（ BSA）、小牛血清（

3、 FCS）、脱脂奶粉等。在夹心 ELISA 中 封 闭 可 以 省 略 掉，但 在 间 接ELISA 中封闭则是必要的1。1 材料和方法1. 1 包被抗原和血清抗原为 EDTA 法提取的巴氏杆菌细胞成分 ，血 清 为 巴 氏 杆 菌 经 甲 醛 灭 活 后 加 入Al（ OH）3胶免疫小尾寒羊所得的阳性血清，收稿日期：20060524作者简介：毛东风（1981），河南省柘城县人，硕士研究生，主要从事动物腹泻病防治方面的研究。阴性血清为小尾寒羊免疫前采取的血清。1. 2 其它材料血清白蛋白（ BSA）、小牛血清（ FCS）、脱脂奶粉、兔 抗 羊HRP 标 记 抗 体（ 博 大 泰 克产）、96孔

4、 酶 标 板（ 博 大 泰 克 产）、Multiskan酶标仪（ Thermo 产）、OPD，其它材料均为国产分析纯。1. 3 包被抗原的提取并用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度取培养好的巴氏杆菌血琼脂培养皿2，用含 1% 石炭酸的 PBS 5 mL 洗下菌苔，1 000X g 离心 15 min，取沉积体悬浮于 10 mL PBS中。取菌液于血球计数板上计数并调菌液CFU 为 1010，加入 EDTA 二钠使菌液终浓度达到 10 mol / L。然后置于 45C 水浴 1 h，随后晃动 30 min。4 000 X g 离心 30 min，取上清装入透析袋中于生理盐水中透析 12 h，透析过的溶液用

5、蔗糖浓缩原体积 1 / 2 。2 000 X g离心 15 min，取上清用考马斯亮蓝法测定其蛋白浓度为 1. 41 mg / mL。分装置于 - 20C保存3。1. 4 方 阵 法 测 定 抗 原 和 血 清 最 佳 工 作 浓度410甘肃畜牧兽医 2007 年 1（ 总 192）期以 pH9. 6 的碳酸盐缓冲液将抗原从 1f根据 1. 4 步骤所测定的最佳工作浓度再50 稀释至 1 f 3 200，每孔加入 100 !L，37C水浴 2 1 后 4C 过夜包被。然后用含 0. 5% 吐温 - 20 的PBST 液 洗 3 min X 3次，加 入 含1% BSA 的 PBS 封闭液 15

6、0 !L / 孔，37C 水浴2 1 后 4C 过夜。PBST 洗 3 min X 3 次。将阳性血清分别稀释 50、100、200 倍 100 !L / 孔加入，水浴 2 1，用 PBST 洗 3 min X 3 次。按说明将标记的兔抗羊血清 1f 1 000 倍稀释，每孔加入 100 !L，37C 水浴 2 1，PBST 洗 3 minX 3 次。加 入 OPD - H2O2底 物 液 100 !L /孔，置 于 暗 盒 内 反 应 10 min，用 2 mol / L的H2SO4终止液 50 !L / 孔终止后于酶标仪上双波长测定 OD492 - 630 。每孔均做复孔，取其平均值5。1

7、. 5 封闭方法选择用含 1% BSA、10% 小牛血清（ FCS）、10% 脱脂奶粉、0. 5% BSA + 2% 蔗糖的 PBS 封闭液分别用 3 种封闭方法：37C 水浴 2 1 后 4C 241、4C 24 1、37C 水浴 3 1。并用一组不加封闭液做对比，其它均同 1. 4 步骤，进行测定，每孔均做复孔，取其平均值。2 结果2. 1 抗原和血清最佳工作浓度方阵试验结果如表 1 所示。当抗原稀释400 倍，血清稀释 100 倍时阳性血清 OD492 - 630为 0. 981，而阴性血清 OD492 - 630 为 0. 071，P / N为 13. 82。所以抗原最佳工作浓度为 1

8、f 400（3. 6 !g / mL），血 清 的 最 佳 工 作 浓 度 为 1 f100。血清稀释度血清1f 50表 1 方阵滴定试验结果OD492 - 630抗原稀释度1f 1001f 2001f 4001f 8001f 1 6001f 3 200lf 50阳性阴性1. 4980. 1821. 3190. 1311. 1750. 1180. 9430. 0970. 7100. 0890. 5970. 0830. 4720. 0711f 100阳性1. 3271. 2191. 1070. 9810. 7600. 6510. 4241f 200阴性阳性阴性0. 1221. 1450. 114

9、0. 0990. 9730. 0830. 0790. 8870. 0740. 0710. 8320. 0670. 0650. 6180. 0590. 0570. 5390. 0490. 0560. 3100. 0442. 2 最佳封闭方法的选择表 2所 示，含 0. 5% BSA + 2% 蔗 糖 的PBS 封闭液在 37C 水浴 2 1 后 4C 24 1 时的P / N 最大为 14. 12，为最佳封闭条件。封闭时间血清表 2 封闭液和封闭方法的 OD492 - 630封闭液1% BSA10% FCS10% 脱脂奶粉0. 5% BSA + 2% 蔗糖未封闭4C24137C水浴 3 137C

10、水浴 2 1 后 4C24 1阳性阴性阳性阴性阳性阴性1. 0290. 0761. 0180. 0770. 9540. 0720. 9650. 0710. 9740. 0730. 9830. 0781. 0850. 0831. 1200. 0851. 0690. 0790. 9880. 0740. 9660. 0740. 9740. 0690. 8730. 1230. 9370. 1300. 9250. 1143 小结现代医学中间接 ELISA 被大量用来检测 疫 苗 免 疫 状 况 和 机 体 感 染 情 况，间 接ELISA 只要更换不同的固相抗原就可用同一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗

11、体，所以其 非 常 方 便。 而 且 大 量 试 验 证 实 间 接ELISA 具有很高的灵敏性，其检测水平可达ng / mL6。此外 ELISA 还有着特异性、快速、准确等特点，特别是近十年酶标仪的系统化使间接 ELISA 的使用更加普遍。封闭是一项制约间接 ELISA 准确性的重要条件，在细菌性抗体中存在着大量蛋白、多VOI. 37，N1 研究报告无角陶塞特、波德代和小尾寒羊杂交 F1生长发育及肉用性能观测试验杨瑞基，权金鹏，魏玉明，冯国廷，祁发娴（ 张掖市兽医工作站，甘肃 张掖 734000）11摘要：引进无角陶塞特和波德代与我市饲养的小尾寒羊进行杂交改良，杂一代表现出明显的杂种优势和肉

12、用特征。在相同的饲养条件下，与小尾寒羊比较，陶寒杂交 F1羔羊公母平均初生重比小尾寒羊提高 21. 9% ，1 月龄、3 月龄、6 月龄和 8 月龄体重分别提高 15. 7% 、23. 6% 、20. 1% 和 21. 4% ，初生至 8 月龄的平均日增重提高 17. 9% ；6 月龄平 均 体 高 增 加 14. 4% ，体 长 增 加 18. 7% ，胸 围 增 加30. 2% ，管围增加 11. 3% ；8 月龄胴体重提高 38. 21% ，净肉重提高 47. 09% 。波寒杂交 F1羔羊公母平均初生重比小尾寒羊提高 20. 0% ，1 月龄、3 月龄、6 月龄和 8 月龄体重分别提高

13、19. 2% 、26. 3% 、23. 1% 和 28. 6% ，初生至 8 月龄的平均日增重提高 29. 2% ；6 月龄平均体高增加 13. 7% ，体长增加17. 5% ，胸围增加 28. 0% ，管围增加 10. 7% ；8 月龄胴体重提高 47. 07% ，净肉重提高 58. 5% 。关键词：无角陶塞特；波得代；杂交；小尾寒羊；F1生长发育和肉用性能；试验中国图书分类号：S 826. 3+2 文献标识码：A 文章编号：1006799X（2007）01001104无角陶塞特和波德代绵羊是世界著名的肉羊品种，具有性早熟、不择食、抗逆性强、耐热、适应干燥气候、繁殖能力强、生长发育快、肉质好

14、、生产性能高等特点，其外部特征为体躯呈圆桶形，体质结实，结构紧凑，肩宽背平，四肢短而粗壮，臀部宽圆，肌肉丰满，既适合于放牧，又适合于舍饲，是理想的杂交父本。小尾寒羊俗称鲁西高腿小尾寒羊，产于我国黄淮地区，中心产区在山东荷泽，具有生长发育快、性成熟早、繁殖能力高、产多羔、适应性好、抗逆性强、耐粗饲、采食快等特点，体长而高大，鼻梁隆起，耳大下垂，四肢细长，全身纯。糖抗体。所以要降低它们对相关抗体的影响，育出版社.必须利用无关物质来填充包被抗原余下的空隙。合适浓度的 BSA 和蔗糖 PBS 液显示了良好的封闭性，其效果和稳定性比其他封闭液P / N 高数点，而要比不加封闭液高近 1 倍。主要参考文献

15、1焦奎，张书圣. 酶联免疫分析技术及应用 M.北京：化学工业出版社，2004.2沈萍，李光武. 微生物学实验 M.北京：高等教3余冰宾. 生物化学实验指导M. 北京：清华大学出版社，2004 年.4沈关心，龚非力. 抗体技术实验指南 M. 北京：北京科学出版社，2002. 134143.5黄金海，王英珍. 间接 ELISA 检测综合症病毒抗体方法的建立J. 天津农业科学. 2004（2）：10 - 13.6吕世静. 临床免疫学检验 M. 中国医药科技出版社，2004.7崔保安，扬明凡. 间接 ELISA 检测羊伪狂犬病抗体方法的研究J.畜牧与兽医. 2003（1）：10 - 12.间接ELISA在检测巴氏杆菌抗体中封闭条件的选择作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：参考文献(7条)毛东风，王康英，刘翊中，冯若飞，孙会芳，佟辉西北民族大学,生命科学与工程学院,甘肃,兰州,730030甘肃畜牧兽医GANSU ANIMAL