AS模型兔主动脉平滑肌与骨骼肌中VLDL受体亚型的分布和表达

1、    【摘要】  极低密度脂蛋白受体（VLDLR）分为两型，型受体含有胞外O连接糖链结合域，型受体不含O连接糖链结合域。在疾病状态下，某些组织中VLDLR亚型分布发生改变，为了验证VLDLR亚型分布变化是否与机体脂质代谢紊乱有关，运用RTPCR技术对VLDLR亚型在动脉硬化（AS）家兔模型组织中的分布和表达进行研究。研究发现，与正常家兔相比，在AS家兔中，骨骼肌型受体表达略有上调，主动脉平滑肌型受体上调幅度比骨骼肌高，但亚型分布并没有明显改变。 【关键词】  极低密度脂蛋白受体（VLDLR）; VLDLR亚型;

2、OLink糖链结合域极低密度脂蛋白受体（VLDLR）1属于低密度脂蛋白受体（LDLR）超家族2，主要结合富含ApoE的脂蛋白（VLDL、LDL、LPR、CM、CM残粒）。该受体广泛分布于哺乳动物体内的各种组织，但不同的组织表达量并不一样，在甘油三酯活跃的心肌、骨骼肌、脂肪、大脑组织中，VLDL受体的表达较高，其次是肾脏、胎盘、胰腺、肺和大脑，肝脏中表达微量或没有表达24，说明VLDLR的主要功能是介导组织细胞摄取富含apoE的脂蛋白而参与甘油三酯的代谢5。    VLDLR超家族在结构上的共同特征包括：N端富含半胱氨酸的配体结合重复序列（Ligandbinding repe

3、ats,LBR），此为配体结构域;表皮生长因子前体同源重复序列；丝氨酸、苏氨酸副集区，由第16外显子编码，此区域是受体紧靠胞膜的胞外段，可通过OO连接与炭水化合物连接形成衣被；单链跨膜区；胞内区（具一致性四肽序列AsnProTyr,NPXY的内吞信号），每个区域均负担特定的功能。该家族成员之间最突出的差异在与LBR的数目。LDLR含7个LBR，VLDLR含8个LBR68。Yamamato等人对日本大耳白兔各组织的VLDL受体进行研究，发现VLDLR存在16外显子剪切变异体，于是根据VLDL受体胞外段是否含有Olink糖链结合域分为两种亚型，型受体含有此区域，型受体不含此区域。O连接糖链域的缺失

4、据认为是在受体mRNA成熟过程中不同的选择剪切所致。两种亚型的VLDLR的组织分布并不一致：型受体主要分布于骨骼肌、心肌、脂肪、脑干等组织中；型受体主要分布于肺、脾脏、肾脏、肾上腺、睾丸、卵巢、子宫、大脑、小脑等组织器官和某些病理条件下的组织细胞中。对两种受体的功能研究显示，两种亚型的VLDLR均可与VLDL、RAR结合，型受体摄取VLDL的能力与稳定性均强于型受体，型VLDL受体胞外段水解脱落的更快，但两种亚型受体在受体的摄取、内吞、胞内降解等方面无明显差别。    本实验对VLDLR两种亚型在正常和AS家兔骨骼肌和主动脉平滑肌中的分布进行研究，并进一步探讨造成受体亚型表

5、达变化的原因，以期获得VLDLR亚型表达与分布相关的资料以及对VLDLR的功能与调节的初步研究。1   材料与方法1.1  材料1.1.1  试剂  异硫氰酸胍、DEPC、MMLV反转录酶、 Oligo d（T）、Taq聚合酶，均购于Promega公司; 氯仿、异丙醇购于上海试剂公司; 水饱和酚购于北京Bioasia公司; dNTP购于TaKaRa公司;胆固醇购于上海试剂公司。1.1.2  实验标本    正常家兔组织取材：取正常家兔1只，颈动脉放血法处死，打开胸腔，取骨骼肌

6、约1mg。取下主动脉从左心室到膈肌这一段剪下，PBS冲洗去血液，将动脉剪开，用大头针固定于蜡块上，用手术刀轻轻刮表面破坏内皮，PBS再次漂洗，用手术刀轻轻在动脉内面划“井”形切口，用眼科镊撕下动脉平滑肌层，约1mg。加入变性剂（异硫氰酸胍，十二烷基肌酸钠，柠檬酸钠，巯基乙醇）700l，-70冷冻保存。    动脉硬化（AS）模型兔的取材：选取36月龄的健康家兔，建立动脉硬化（AS）模型兔，所用兔饲料为普通干饲料中添加3%甘油三酯和1%胆固醇，在饲料房自制。饲养3个月后，取兔的骨骼肌、主动脉平滑肌层各约1mg，加入变性剂（异硫氰酸胍，十二烷基肌酸钠，柠檬酸钠，巯基乙醇）700

7、l，-70冷冻保存。1.2  方法1.2.1  总RNA的提取  取1mg组织，加入700l变性剂，冰浴，匀浆至无明显组织块，置冰中5min，加入NaAc（4mmol/L，pH 4.2）70 l，震荡混匀，冰浴1min；加入等体积酚/氯仿混合物（4：1），震荡混匀；静置5 min；4离心12,000rpm 15min; 弃沉淀，移上清液入一新的EP管，加等体积异戊醇沉淀2hr，离心15,000rpm 30 min，可见微黄色的RNA沉淀，溶于适量去离子水中。取1l稀释250倍，经紫外分光光度计分析，如果OD260/OD280>1

8、.9,则表明蛋白质杂质较少，可用于反转录。1.2.2  逆转录反应  每管取总量为1g的RNA溶液, 加入1l  oligo d(T), 加入去离子水至总体积为15l，混匀，70, 5min，后迅速置于冰中冷却1 min；各管中加入反应混合液11l (MMLV反转录酶1l(5u), 5×buffer 5l, dNTP 2.5l (4×10mmol/L), 去离子水2.5l ) ，总体积为26l。42, 1hr；72, 15min，终止反应, 放置- 20保存cDNA。1.2.3   PCR 反应

9、  Olink 糖链结合域两端的引物9位于VLDL受体cDNA的2243bp至2556bp处，编码VLDL受体胞外段紧靠胞膜富含苏氨酸/丝氨酸的区域，型受体的扩增片断为355bp，型受体的扩增片断为271bp:    P1 5GCC  ACT  CTA  GTC  AAC  AAC  CT3    P2 5GAA  GTC  CCT  TTT &#

10、160;GGG  GGA  AC3    actin引物的扩增区域为人类细胞微球蛋白基因的保守区域，所扩增的片段为316bp:    P1  5TGA  GAC  CTT  CAA  CAC  CCC  AG3    P2 5GCC  ATC  TCT  TGC  TCG

11、0; AAG  TC31.2.4  半定量RTPCR  以actin为内参照，以减低扩增片段对扩增效率的影响，actin参照条带长度为316bp，与糖链结合域的条带长度近似，所以检测各组织亚型表达时，将两种引物进行异管同时扩增，actin引物与糖链结合域引物浓度比为1：1。1.2.5  电泳鉴定与扫描定量  2.5%琼脂糖凝胶电泳,将凝胶置于紫外分析仪中，用数码相机在适宜的曝光时间下拍照，并将照片的数据直接输入计算机中，使用GIS凝胶分析软件进行不同条带的峰面积和峰密度扫描定量分析,以

12、峰平均密度代表受体的表达量对所得数据进行单因素方差分析。2  结果    模型兔以普通饲料添加3%甘油三酯和1%的胆固醇经3个月喂养处死，其血浆脂质浓度见表1。表1  阴性对照正常兔和AS兔的血浆脂质浓度（略）为了检验动脉硬化是否对VLDLR的表达量产生影响，将正常家兔和AS家兔各组织进行PCR扩增组织RT产物时，同时加入扩增糖链结合域和actin蛋白的两对引物进行异管PCR扩增。因actin在细胞中稳定表达，将actin条带平均密度作为VLDLR表达量的内参照，以VLDLR条带与actin条带平均密度比作为细胞内VLDLR的表达平均

13、值。电泳结果、扫描数据及对两组数据进行单因素分析结果如下：泳道2：正常骨骼肌；泳道3、4: AS骨骼肌；泳道5：正常骨骼肌actin；泳道6、7： AS骨骼肌actin图1  泳道1：DNA Marker  PBR322/MSP（略）表2  用Gis对家兔两种骨骼肌中VLDLR表达量进行扫描（略）泳道1：DNA Marker  PBR322/MSP；泳道2、3：AS主动脉平滑肌；泳道4: 正常主动脉平滑肌；泳道5、6：AS主动脉平滑肌actin；泳道7：正常主动脉平滑肌actin图2  正常和A

14、S家兔主动脉平滑肌VLDL受体的半定量PCR结果表3  用Gis对家兔两种主动脉平滑肌组织中VLDLR表达量的进行扫描（略）结果显示，与正常家兔相比，虽然亚型分布并没有明显改变，但在动脉硬化（AS）家兔中，型VLDLR在骨骼肌、主动脉平滑肌中的表达略有上调，其中主动脉平滑肌上调约20%，幅度较骨骼肌高，而受体没有变化。这说明高脂血症可促进型受体在主动脉平滑肌中的表达，高表达的型受体的意义可能在于促进平滑肌细胞摄取VLDL，导致脂质在平滑肌细胞中的堆积，使平滑肌细胞转变为泡沫细胞从而使动脉粥样斑块的形成。3  讨论    自从Yamam

15、oto报道VLDLR这两种亚型以来， VLDLR两种亚型在各组织中的分布以及分布特点的生理意义成为研究热点。结合本实验室对人体组织中VLDLR各亚型分布的检测和本实验对家兔2种组织中VLDLR各亚型分布的检测，及其它动物体内VLDLR亚型分布的报道，可得知VLDLR亚型的分布方式与组织脂代谢水平相关，脂代谢旺盛的组织主要表达脂质摄取功能较强的VLDLR受体亚型。    在AS模型兔的主动脉粥样斑块病变中，脂蛋白受体如LDLR、VLDLR、LRP均增高，其中VLDL受体的增高最明显，有100倍以上10。本实验室通过对肝硬化病人和糖尿病的病人研究发现，肝硬化病人的脾脏、脂肪组织

16、中的型受体表达减少或消失，骨骼肌中的型受体的表达略有增高；糖尿病病人的脂肪组织中，型受体的表达也降低或消失。以上结果提示机体为了适应内环境的变化可对VLDLR的亚型表达进行调节。    高脂血症不仅使VLDLR表达的量上调，还可在转录水平通过选择性剪切调节受体亚型的表达。由于两种亚型的VLDLR是细胞内RNA成熟时的不同剪切所致，在机体细胞中并无两种亚型的VLDLR基因，高脂血症引起亚型的变化可能是高脂血症诱导细胞内产生相应的调节信号，作用于参与hnRNA剪切的酶类，抑制对16外显子的切除，主要表达摄取功能较强的型受体，而摄取功能弱较的型受体的mRNA量减少或消失11。&#

17、160;   本实验的结果表明，在喂食高脂饲料的中国大耳白兔的主动脉平滑肌与骨骼肌组织中，尽管兔血的各种脂质浓度增高，但与阴性正常兔相比，VLDL受体各亚型的分布无明显变化，这种结果与细胞模型的结果不符，可能由于在体内的情况下，机体不仅存在脂质浓度的提高，激素的分泌也对VLDL受体的表达和亚型产生影响。另外，同时增加的LDL对VLDL受体表达的上调作用是相对于两种亚型的VLDL受体均有效，高VLDL对型受体表达的下调作用被LDL的上调作用抵消，高脂血症对型受体的影响在短时期内不明显；也可能是由于VLDL的亚型变化在体内的情况下机体的代偿能力较强，出现转录剪切变化较晚有关。总之，在机体

18、生理功能和机体正常生理环境紊乱时，VLDL受体的表达量和亚型分布产生复杂的变化，以适应机体的功能的需要。    至今，对VLDL受体亚型分布的变化的研究还鲜有报道。由于VLDL受体在脂代谢中的变化十分明显，在引起机体代谢紊乱的各种疾病中可作为一个判断外周组织受病变影响程度的一个辅助指标，但其意义和确定性也待进一步研究。【参考文献】  1 Takahashi S, Kawarbayasi Y, Nakai T, et al. Rabbit very low density lipoprotein receptor:a low densitylpoprote

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20、l Mo Genet, 1993, 19: 557569.3 Oliver Tiebel, Kazuhiro O, Kathy R, et al. Mouse very low density lipoprotein receptor(VLDLR):gene syructure,tissue specific expression and dietary and developmental reulation. Atherosclerosis, 1999, 145: 239251.4 Nakamura Y, Yamamoto M, Kumamaru E. Very lowdensity lip

21、oprotein receptor in fetal intestine and gastric adenocarcinoma cells. Arch Pathol Lab Med，2000，124: 1 1191 122.5 Gafveels M, Paavola L, G,Boyd C, et al. Cloning of a complementary deoxyribonucleic acid encoding the murinehomolog of the very lowdensity lipoprotein/ apolipoprotein E receptor:expressi

22、on pattern and assignment of the gene to mouse chromosome19. Endocrinology, 1994, 135: 384394.6 Bujo H, Yamamoto T, VLDL receptor in health and disease:interview with a receptorin avian oocytes and mammalian muscle and fat cells. Atheroscler Thromb, 1996, 2(2): 7175. 7 Jingami H, Yamamoto T, The VLDL receptop: wayward brother of the LDLfamily. Curr Opin Lipido, 1995, 48: 104108.8 Yamamoto T, Hoshino A, Taahashi S, et al. The role of the very low density lipoprotein receptor in t