生物制药重点(1)

1、生物制药重点第2章 基因工程制药1、 基因工程菌的构建与筛选：1、构建菌种流程：载体选择：质粒载体、噬菌体载体；目的基因制备：化学合成、PCR扩增、基因文库法、cDNA文库法；载体与目的基因连接：黏性末端DNA与载体连接、平头末端与载体相连；导入受体细胞：导入大肠杆菌、导入酵母、导入链霉菌、导入哺乳动物细胞；重组子筛选与鉴定：载体遗传标记法（抗生素抗性筛选、互补筛选、营养缺陷型筛选、噬菌斑筛选）、核酸分子杂交（菌落原位杂交、DNA印迹分析、RNA印迹分析）、限制性内切酶图谱法、DNA序列测定法、目的基因表达产物测定法；2、 载体与目的基因连接方式：1、黏性末端与载体连接：目的基因经过双酶切获得

2、不同黏性末端的两端；2、影响连接的因素：连接方式、目的基因与载体的浓度及比例、温度。3、 载体类型：1、质粒载体：复制子、选择标记基因、多克隆位点，质粒是指独立于原核生物染色体之外具有复制能力的遗传物质，大小为1300kb，有三种构型：共价闭合环状DNA（cccDNA）；开环DNA（ocDNA）；线状DNA（lDNA）。2:、噬菌体载体：常用于构建基因文库和cDNA文库，分为两类即插入型载体是指载体中一个酶切位点用于外源DNA的插入；置换型载体是指外源DNA通过置换载体上非必须序列插入载体。第三章一、体外培养动物细胞的类型根据体外培养时动物细胞对生长基质的依赖性贴壁依赖性细胞（成纤维细胞型、上

3、皮细胞型）非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞）、兼性贴壁细胞二、动物细胞培养的环境条件培养温度、动物细胞最佳培养温度：37 、昆虫细胞最佳培养温度：25-28 、温度过高：细胞退变甚至死亡、温度过低：降低代谢和生长速度，影响产量pH值、动物细胞培养的最适pH为7.27.4，低于6.8或高于7.6会对细胞产生不利影响，严重时可引起细胞退变甚至死亡。培养基应具有一定的缓冲能力，必须加入缓冲系统： 如HEPES、 Na2HPO4/ NaH2PO4缓冲系统、 NaHCO3/CO2缓冲系统等通氧量、动物细胞培养时对氧气的要求与微生物是不一样的，在培养中要使用CO2培养箱，通入一定的CO2。不同的细胞对氧和CO2

4、的比例要求不一样。防止污染、细菌污染，时间：在24 48h左右即可发现肉眼观察：培养液变浑浊。镜检：被污染的细胞有泡状突起，细胞内含大量颗粒状内容物，细胞间有大量活跃运动的细小颗粒，细胞大量死亡。其他检测方法：细胞置于无抗生素的培养液。真菌污染，时间：培养72h左右才可发现。酵母污染：类似于细菌污染，可观察到圆形或卵圆形的酵母菌；发酵样气味，外观呈黄绿色。霉菌污染：树枝状生长的菌丝。支原体污染：直接培养法、相差显微镜检测DNA荧光染色法、PCR法、扫描电子显微镜或透射电子显微镜。预防措施（1）器材的清洗：浸泡（3%磷酸三钠）刷洗、泡酸（重铬酸钾、硫酸、水）冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水）（2）

5、器材的消毒灭菌：物理方法：如紫外线、干热、湿热、过滤、化学方法：如化学消毒剂、抗生素基本营养物质、营养物质：能进入细胞中被细胞利用和参与细胞代谢活动的物质。碳水化合物，蛋白质，脂类，维生素，激素类物质和促细胞生长因子渗透压、细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。最理想的渗透压为260320mOsm/L为调整培养液的渗透压，一般采用加减NaCl的方法： 1mg/ml NaCl-32mOsm/kg，在细胞培养操作中，为保持合适的渗透压和pH，一般都使用平衡盐溶液（BBS），由无机盐和葡萄糖组成。三、动物细胞的冻存与复苏细胞的冻存：采用液氮低温（-196）冻存：加保护剂如甘油

6、和二甲亚砜；冷冻速度以1/min的速度下降为宜。注意事项：冻存前一天换液培养；细胞密度以1-2106个/ml为宜；冻存用培养基应与实际使用的一致，DMSO过滤除菌；检查安踣的密封性；标签要写上细胞名称，编号和冻存日期。细胞的复苏（总的要求是快融）注意事项：操作中注意防护，戴面罩和手套；从液氮中取出后，立即丢入37-40温水的搪瓷杯中，并搅动加速融化；用乙醇消毒安瓿外表；尽早除去二甲亚砜，离心，换新鲜培养液；隔天观察细胞生长情况，再换液一次。四、生产用动物细胞的种类1、原代细胞：直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。如鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细胞、淋巴细胞等。用原代细胞生产

7、生物制品常需要大量的动物，费钱费力。2、传代细胞系（二倍体细胞系）：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。由于该类细胞寿命有限，一般从动物的胚胎组织中获取。如WI-38、MRC-5、2BS等。3、转化细胞系：失去了正常细胞的特点，获得了无限增殖的能力。转化细胞系具有无限生命力，常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，更适于大规模工业化生产。如Namalwa、CHO、BHK-21、Vero细胞等。4、工程细胞系：是指采用细胞融合技术或基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系，其中CHO细胞

8、被应用的最多。融合细胞系：通过动物细胞融合技术而构建。基因工程细胞系：可采用基因工程的手段构建各种工程细胞。五、动物细胞工程制药技术（一）、细胞融合：指在外力作用下，两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。融合细胞的构建主要包括细胞融合和细胞筛选两个过程。细胞融合的方法主要有：病毒法（仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒）、PEG法、电击法、激光法。筛选方法主要有：利用各种营养缺陷型细胞系或抗性细胞系作为参与细胞融合的亲本细胞，通过选择培养基将互补的杂交细胞筛选出来；利用或人为地造成两个或几个亲本细胞之间的物理特性差异，如大小，颜色，漂浮密度等不同，从中筛选出杂交细胞。利用或人为地造成杂种细胞与

9、未融合的细胞之间生长或分化能力等方面差异，从而筛选。（2） 、转基因动物制作方法：基因显微注射法，反转录病毒感染法，胚胎干细胞法，精子载体导入法，基因打靶法，酵母人工染色体法。（3） 、转基因动物乳腺生物反应器：转基因动物本身、转基因动物的器官和组织。优点：表达的产物能充分修饰且具有稳定的生物活性，产品成本低，可大规模生产，产品质量高且易纯化。类型：转基因动物乳腺生物反应器、转基因动物血液生物反应器、转基因动物尿液生物反应器、转基因鸡（蛋）生物反应器外源基因在乳腺的特异性表达需要乳蛋白质基因的一个启动子和调控区。第四章抗体（antibody，Ab）：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋

10、白，生物学功能上的概念。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，化学结构上的概念。抗 原(antigen,Ag)：是指那些能够刺激和/或诱导机体免疫系统发生免疫应答、产生抗体和/或致敏（效应）淋巴细胞，同时又能与免疫应答产物在体内外特异性结合，发生免疫反应的物质。1、 抗体的制备原理（细胞膜的流动性）及步骤：定义：将在体外不能长期传代的抗体产生细胞（如Balb/C小鼠的免疫脾细胞）与在体外能迅速增殖并带有抗药标记的骨髓瘤细胞（如小鼠的NS-1或SP2/0）在聚乙二醇（PEG）作用下融合，然后利用抗药性标记和经稀释法选出单个产生抗体的杂交瘤细胞

11、，再用血清学方法证实其与抗原结合的特异性和亲和力。这样的杂交瘤细胞能长期传代同时分泌针对单一抗原上单一抗原表位的抗体，称为McAb（第二代抗体）。单克隆抗体制备流程图二、抗体工程制药的产品及其发展：抗体工程制药是指利用基因工程、细胞工程、转基因动物及转基因植物技术生产抗体药物的过程。产品第一代：抗血清第二代：单克隆抗体第三代：基因工程抗体优点对多表位抗原中和能力强结构均一、纯度高、特异性强、效价高、血清交叉反应少或无、成本低人源化、均一性强、可工业化生产缺点安全性低、供应量有限、批次间差距大、有效抗体成分低、不能进行基因改造对人有较强的免疫原性，可能导致机体免疫组织细胞受损。亲和力弱、效价不高

12、三、单链抗体：1、定义：利用DNA重组技术将抗体的一条重链VH和一条VL基因通过一条短肽（linker）连接后表达出来的抗体片段。2、ScFv的基因构建过程：用PCR技术从杂交瘤细胞的基因组DNA或RNA逆转录后的cDNA中扩增出VH和VL基因，用编码寡核苷酸接头（linker）将两者连接成scfv基因。连接方法：将接头设计在表达载体上，两端各有限制内切酶供VH和VL的插入；通过将接头的编码序列分别设计在扩增VH和VL引物中，用PCR直接合成scfv基因，此方法被称为重叠延伸拼接法。四、噬菌体抗体库技术的基本原理和程序：定义：是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。将某种动物

13、的所有抗体可变区基因克隆在噬菌体表达载体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。程序：抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合。人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人噬菌体抗体库的筛选是关键环节步骤：淘筛和鉴定。方法：固相或液相纯化抗原筛选、全细胞筛选、用切片组织进行筛选。第五章1、 疫苗的种类（一）减毒活疫苗： 定义：使病原体的致病性减弱或丧失后获得的一种由完整的微生物组成的疫苗制品。原理：模拟自然发生的感染后免疫过程。产品：卡介苗、脊髓灰质炎疫苗、炭疽疫苗、伤寒疫苗、水痘疫苗、狂犬病疫苗、黄热病疫苗、腺病毒疫苗、轮状病毒疫苗

14、。（二）灭活疫苗：定义：使病原体完全丧失感染性，保留病原体几乎全部组分。优点：较强的免疫原性和较好的安全性。产品：伤寒疫苗、霍乱疫苗、鼠疫疫苗、百白破疫苗、流感疫苗、立克次氏体疫苗、脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗、乙脑疫苗。（三）联合疫苗：由两种以上的细菌(或病毒)联合制成的疫苗，一次免疫可达到预防几种疾病的目的。传统的联合疫苗：灭活和减毒疫苗；新型的联合疫苗：基因程度的联合；多联疫苗不同病原微生物：百白破联合疫苗、多价疫苗同一种微生物的不同亚型：23价肺炎多糖疫苗（四）亚单位疫苗：纯化亚单位疫苗、合成肽亚单位疫苗、基因工程亚单位疫苗。（五）核酸疫苗：优点：体内可持续表达，免疫效果好，维持时间长；

15、便于操作，制备简单，节约成本；能制备联合疫苗；载体能重复使用；可用于免疫治疗；缺点：其机制和安全性尚不完全清楚；免疫效果有待提高。（六）治疗性疫苗： 传统意义上疫苗都是预防性的疫苗，在已感染或已患病个体诱导特异性免疫应答，清除病原体或异常细胞，使疾病得以治疗，用于病毒感染、肿瘤等疾病的治疗活疫苗与灭活疫苗的特点比较制备 接种次数/量诱导的免疫类型回复倾向 筛选无毒株/人工定向变异一般仅需要一次/小相对稳定性不稳定体液免疫和细胞免疫可以回复为毒株需要多次接种/大较稳定体液免疫不回复为毒株体内繁殖无类似轻度感染免疫力强弱接种反应小大灭活疫苗特性活疫苗第6章 酶工程制药1、 酶和细胞固定化（一）酶的

16、固定化定义：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶固定在载体上,并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。（1）可提高酶的稳定性。（2）酶能回收，易与产物分离，可反复使用。传统方法：载体结合法（吸附法、离子结合法、共价结合法）、交联法、包埋法（网格型、微囊型）。吸附法：依据酶或细胞和载体之间的非特异性物理吸附作用，使酶或细胞吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。根据吸附剂的特点分为: （1）物理吸附法：作用力：氢键、疏水键、范德华力、静电，常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。（2）离子结合法：作用力：离子键。常用载体：DEAE-纤

17、维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素等。优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：结合力弱，易解吸附。共价结合法：借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。此法与共价结合法利用的均是共价键，不同之处：交联法不使用载体。缺点：(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。包埋法：将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。包埋法是目前应用最多的一种较

18、理想的方法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。（2） 细胞的固定化固定化方法：直接固定法 不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。吸附法包埋法。固定化酶（细胞）的性质变化：酶活力的改变：通常低于天然酶（有例外）。原因：酶的构象发生变化，影响活性中心的氨基酸；空间障碍：形成立体屏蔽；内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；包埋时，大分子底物不能透过膜。酶的稳定性：酶的耐热性提高，对变性剂、抑制剂、pH值、蛋白酶以及操

19、作条件的抵抗力增加。可能原因：固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形。抑制酶的自身降解。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。最适温度：最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。最适PH：带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。带正电荷载体：最适pH 向酸性偏移。纳豆激酶：纳豆发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，用于治疗血栓。尿酸氧化酶：用于治疗痛风。酶的化学修饰：概念：利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上，或将酶分子的某部分删除或置换，改变酶的理化性质及生物活性，这种应用化学方法对酶分子进行改造的技术。方法：交联技术、定点突变和化学修饰结合技术、用小分子化合物修饰、用单功能聚合物的修饰、引入辅助因子。第7章 发酵工程制药1、 获得优良菌种：1、理想的发酵菌种应符合要求：遗传性状稳定；生长速度快、不易污染；目标产物产量尽可能接近理论转化率；目标产物最好分泌到胞外；尽可能减少类似物的产量；其所利用生长的培养基成分简单、价格低廉。2、经验育种方法：自然选育、诱变育种、杂交育种。定向育种：控制杂交育种、原生质体融合、基因重组。2、 菌种保藏：1、沙土管保藏法适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，如毒三素链霉菌