Ⅳ 酶的提取与分离纯化ppt课件

1、1.1.预处理预处理2.2.细胞过滤分离细胞过滤分离3.3.酶提取酶提取4.4.酶分离纯化酶分离纯化5.5.酶浓缩、结晶、枯燥酶浓缩、结晶、枯燥6.6.酶保存酶保存7.7.酶制剂成型酶制剂成型酶工程下游技术操作条件酶工程下游技术操作条件1.1.加热：使温度达到最适温度加热：使温度达到最适温度2.2.凝聚，絮凝凝聚，絮凝3.3.加酸碱：达到最适加酸碱：达到最适PHPH1.1.细胞破碎法细胞破碎法机械破碎法：研磨、搅拌、匀浆机械破碎法：研磨、搅拌、匀浆物理破碎法：温度差法、压力差法、超声物理破碎法：温度差法、压力差法、超声 波空穴效应波空穴效应化学破碎法：酸碱，有机溶剂破坏细胞壁、膜化学破碎法：酸

2、碱，有机溶剂破坏细胞壁、膜酶破碎法：加酶破坏细胞壁、膜；最适条件培酶破碎法：加酶破坏细胞壁、膜；最适条件培 养，使溶酶体破裂自溶养，使溶酶体破裂自溶2.2.过滤方法：加压、常压、减压过滤法过滤方法：加压、常压、减压过滤法空穴效应：超声波使发酵液中产生许多小气泡，空穴效应：超声波使发酵液中产生许多小气泡， 气泡破裂产生内爆力使细胞破碎气泡破裂产生内爆力使细胞破碎1.1.本质：使胞内酶溶解到发酵液中，使酶出本质：使胞内酶溶解到发酵液中，使酶出 细胞细胞2.2.方法：盐溶法，有机溶剂溶解法，方法：盐溶法，有机溶剂溶解法，PHPH远离远离 PI PI3.3.条件：条件：T T：0oC-10oC0oC-

3、10oC PH PH：酶活力范围内，远离：酶活力范围内，远离PIPI 提取液体积：酶液体积的提取液体积：酶液体积的2-52-5倍倍T T：0-10oC0-10oC低温低温PHPH：根据要求：根据要求, ,远离或趋近远离或趋近PIPI加酶活保护剂：有机溶剂提取、沉淀分离时加酶活保护剂：有机溶剂提取、沉淀分离时防酶失活防酶失活沉淀分离沉淀分离膜分离膜分离离心分离离心分离层析分离层析分离电泳分离电泳分离等电点分离等电点分离一一 盐析法盐析法1.原理原理:高浓度高浓度(NH4)2SO4中和蛋白质表面电中和蛋白质表面电 荷荷,使同电相斥作用减小凝聚沉淀使同电相斥作用减小凝聚沉淀2.1.1.原理原理:PH

4、=PI:PH=PI时时, ,带电量为零带电量为零, ,同电相斥作用同电相斥作用 最小最小, ,凝聚沉淀凝聚沉淀2.2.留意：等电点法不破坏水膜，不一定沉留意：等电点法不破坏水膜，不一定沉 淀，须与其他方法联合使用淀，须与其他方法联合使用1.1.原理原理: :有机溶剂破坏蛋白质三级结构有机溶剂破坏蛋白质三级结构, ,使非使非 极性基团外露极性基团外露, ,极性基团内藏极性基团内藏, ,使水膜使水膜 破坏破坏, ,凝聚沉淀凝聚沉淀. .一一 压差膜法压差膜法1.1.纳滤：纳滤：2.2.微滤：微滤：3.3.超滤：超滤：1.1.定义：用两块膜把水槽分为三个室，加空定义：用两块膜把水槽分为三个室，加空

5、间电场，使中间室中待分离液中正间电场，使中间室中待分离液中正、 负离子分别电渗到两边的两室负离子分别电渗到两边的两室2.2.留意：正离子向靠近负极的室电渗留意：正离子向靠近负极的室电渗 负离子向靠近正极的室电渗负离子向靠近正极的室电渗1.1.定义：将待分离液装入膜袋中，膜袋外为定义：将待分离液装入膜袋中，膜袋外为 浓度大于或小于待分离液的溶液。浓度大于或小于待分离液的溶液。 利用浓度差使待分离液中水、杂质利用浓度差使待分离液中水、杂质 通过渗透或渗析而与需要的组分分通过渗透或渗析而与需要的组分分 离离2.2.渗透与渗析渗透与渗析浸透：只有溶剂透过膜浸透：只有溶剂透过膜渗析：有溶质透过膜渗析：有

6、溶质透过膜1.1.透水率：透水率：2.2.截留率：截留率：3.3.截留物相对分子量：截留物相对分子量：一一 离心机的选择离心机的选择1.常速离心机：常速离心机：Vmax8000r/min； 用于：用于：2.高速离心机：高速离心机：Vmax（1-2.5）104r/min； 用于：用于：3.超速离心机：超速离心机：Vmax（2.5-12）104r/min； 用于：生物大分子、用于：生物大分子、1.1.差速离心法：利用密度质量数不同的差速离心法：利用密度质量数不同的 物质离心速度不同而分离物质离心速度不同而分离 密度大的物质在离心瓶底部密度大的物质在离心瓶底部 ，密度小的在上部，密度小的在上部2.2

7、.密度梯度离心法：密度梯度离心法：3.3.等密度离心法：等密度离心法：一一 吸附层析吸附层析1.原理：利用各物质在同种吸附剂中扩散速原理：利用各物质在同种吸附剂中扩散速 度不同而分离度不同而分离2.常用吸附剂：常用吸附剂：1.1.原理：利用吸附剂与载体的共同作用，各原理：利用吸附剂与载体的共同作用，各 物质扩散速度不同而分离，比吸附物质扩散速度不同而分离，比吸附 层析效果好层析效果好2.2.三类：滤纸层析三类：滤纸层析 1.1.原理：利用离子交换剂上柱，以离子键与待分离原理：利用离子交换剂上柱，以离子键与待分离物结合，再水洗掉杂质，洗脱剂洗脱待分离物，物结合，再水洗掉杂质，洗脱剂洗脱待分离物，

8、从而得到待分离物，离子键结合稳，效果好从而得到待分离物，离子键结合稳，效果好2.2.几个重要的离子交换剂：几个重要的离子交换剂：3.3.几个重要的洗脱剂：几个重要的洗脱剂：离子交换剂：离子交换剂：阴离子交换剂：带正电的物质，可吸附阴离子阴离子交换剂：带正电的物质，可吸附阴离子阳离子交换剂：带负电的物质，可吸附阳离子阳离子交换剂：带负电的物质，可吸附阳离子层析柱层析柱的准备的准备固定相材固定相材料的准备料的准备装柱装柱平衡平衡上样上样（洗涤和）（洗涤和） 洗脱洗脱收集洗收集洗脱液脱液洗脱液检测，洗脱液检测，绘制洗脱曲线绘制洗脱曲线（柱再生）（柱再生）1.1.原理：待分离液与凝胶溶液混合上柱，利原

9、理：待分离液与凝胶溶液混合上柱，利 用大分子太大，不从凝胶网孔通过用大分子太大，不从凝胶网孔通过 ，而是从凝胶粒子间通过，受阻力，而是从凝胶粒子间通过，受阻力 小，沉降快，而小分子小，可从凝小，沉降快，而小分子小，可从凝 胶网孔通过，在凝胶中受阻力大，胶网孔通过，在凝胶中受阻力大， 沉降慢而分离分子大小差距大的物沉降慢而分离分子大小差距大的物 质质2.2.几种常用凝胶：几种常用凝胶：1.1.原理：固定相上柱成母体，再用母体活化剂为母原理：固定相上柱成母体，再用母体活化剂为母 体引入活泼基团，使母体以共价键与待分体引入活泼基团，使母体以共价键与待分 离物结合，再水洗、洗脱得待分离物，母离物结合，

10、再水洗、洗脱得待分离物，母 体与待分离物结合稳，效果好体与待分离物结合稳，效果好2.2.固定相：固定相：3.3.母体活化剂：母体活化剂：母体：上柱的载体母体：上柱的载体 配体：待分离物配体：待分离物 固定相：同母体固定相：同母体 固定相选择固定相选择 固定相活化固定相活化 层析过程层析过程层析柱层析柱的准备的准备固定相材固定相材料的准备料的准备装柱装柱平衡平衡上样上样（洗涤和）（洗涤和） 洗脱洗脱收集洗收集洗脱液脱液洗脱液检测，洗脱液检测，绘制洗脱曲线绘制洗脱曲线（柱再生）（柱再生）下一轮下一轮上样上样 原理原理 电泳速率只与电泳速率只与Q Q、r r有关电荷效应、分子有关电荷效应、分子筛效应

11、），而筛效应），而Q Q与与PHPH有关有关PHPH趋近趋近PIPI时时Q Q最最小，反之同理），小，反之同理），r r与与M M有关有关M M大则大则r r大，大，反之同理）反之同理） 支持物要求支持物要求均匀、阻力小均匀、阻力小一一 纸电泳纸电泳二二 薄层电泳薄层电泳三三 薄膜电泳薄膜电泳1.1.凝胶的组成与制作凝胶的组成与制作 组成：单体组成：单体+ +交联剂交联剂+ +催化剂催化剂 制造：三种成分混合溶解即可制造：三种成分混合溶解即可2.2.单体、交联剂与凝胶网孔大小的关系单体、交联剂与凝胶网孔大小的关系 单体浓度单体浓度网孔大小网孔大小 交联剂浓度占交联剂浓度占5%5%网孔最小网孔最

12、小3.3.连续凝胶电泳三连续：单体浓度、连续凝胶电泳三连续：单体浓度、PHPH、缓、缓冲液连续冲液连续1.1.三个不连续：单体浓度、三个不连续：单体浓度、PHPH、缓冲液不连、缓冲液不连 续续2.2.三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩 效应效应3.3.三层：样品胶层：最上层，与样品混合三层：样品胶层：最上层，与样品混合 浓缩胶层：样品大多因分子太大浓浓缩胶层：样品大多因分子太大浓 缩于此缩于此 分离胶层：需分离出的样品通过浓缩层，分离胶层：需分离出的样品通过浓缩层， 聚集于分离胶层聚集于分离胶层不连续凝胶电泳比连续凝胶电泳效果好不连续凝胶电泳比连续凝胶电泳

13、效果好1.1.定义：上面单体浓度小，网孔大；往下单定义：上面单体浓度小，网孔大；往下单 体浓度依次增大，网孔依次变小，体浓度依次增大，网孔依次变小， 增大了分子筛效应，比连续凝胶电增大了分子筛效应，比连续凝胶电 泳效果好泳效果好2.2.特点：分子筛效应大于电荷效应，为主要特点：分子筛效应大于电荷效应，为主要 效应效应3.3.作用：不同质量数的物质聚于不同的胶层作用：不同质量数的物质聚于不同的胶层 ，M M大的聚于上层，大的聚于上层，M M小的聚于下层小的聚于下层 可用于测可用于测/ /比较比较M M1.1.电泳速度只与网孔大小分子筛效应有电泳速度只与网孔大小分子筛效应有 关原因关原因 SDS

14、SDS与蛋白质结合，破坏三级结构二硫键，与蛋白质结合，破坏三级结构二硫键，与蛋白质形成复合物，该复合物短轴均为与蛋白质形成复合物，该复合物短轴均为1818埃左右，长轴与埃左右，长轴与M M有关：有关：M M越大越大长轴越长轴越长，长度差距很大，长，长度差距很大， M M越大越大长轴越长，长轴越长，在凝胶中受到阻力越大，电泳速度越小在凝胶中受到阻力越大，电泳速度越小M M与电泳速率有关：与电泳速率有关：可以通过测电泳速率得可以通过测电泳速率得M M1.1.原理：两性离子载体加入到电泳池中，两原理：两性离子载体加入到电泳池中，两 电极通电后，正极到负极电极通电后，正极到负极PHPH依次增依次增 大

15、，不同蛋白质大，不同蛋白质PIPI不同，不同，PH=PIPH=PI时的时的 地方该蛋白质带电量为零，聚集于地方该蛋白质带电量为零，聚集于 此，可用于分离不同的蛋白质此，可用于分离不同的蛋白质2.2.两性离子载体：两性离子载体：一一 有机萃取有机萃取1.原理：利用不同物质在有机溶剂中溶解度原理：利用不同物质在有机溶剂中溶解度 不同而分离不同而分离2.作用：用于分离有机物与无机物作用：用于分离有机物与无机物1.1.双水相的制备方法双水相的制备方法高聚物与高聚物：相互有排斥力，不成单相高聚物与高聚物：相互有排斥力，不成单相高聚物与无机盐：有机物与无机物不成一相高聚物与无机盐：有机物与无机物不成一相2

16、.2.原理：利用不同物质在双水相中溶解度不原理：利用不同物质在双水相中溶解度不 同而分离同而分离3.3.优点：可直接从细胞中提取酶，不用处理优点：可直接从细胞中提取酶，不用处理 细胞残片；可室温下操作，利于工细胞残片；可室温下操作，利于工 业化生产业化生产1.1.原理：超临界流体作萃取剂，利用不同物原理：超临界流体作萃取剂，利用不同物 质在超临界流体中溶解度不同而分质在超临界流体中溶解度不同而分 离离2.2.超临界流体：超临界流体：T T、P P超过临界值形成的流体超过临界值形成的流体 ，性质介于气相与液相之间，性质介于气相与液相之间3.CO23.CO2作萃取剂原因：作萃取剂原因：CO2CO2临界点易达到，临界点易达到， CO2 CO2 的超临界流体易制的超临界流体易制取取4. CO24. CO2作萃取剂优点：作萃取剂优点：CO2CO2无毒、不腐蚀、价格低无毒、不腐蚀、价格低 、可循环利用、可循环利用1.1.原理：利用正胶束与反胶束转换分离出酶原理：利用正胶束与反胶束转换分离出酶2.2.定义定义表面活性剂：极性基团与非极性基团组成的有机物表面活性剂：极性基团与非极性基团组成的有机物正胶束：