GPX、APX、CAT、SOD、AsA、GSH、MDA、Proline、可溶性蛋白、可溶性还原糖、可溶性总糖测定方法

1、抗氧化酶活性测定（APX GPX SOD CAT Pro）参考在同一提取系统 中同时测定5种抗氧化酶活性1、注意事项：在本提取系统中同时测定抗坏血酸专一性过氧化物酶（APX、愈创木酚过氧化物酶（GPX、超氧化物歧化酶（SOD、过氧化氢酶（CAT、可 溶性蛋白共5个指标；所有操作过程必须在冰浴中完成，降低保护酶活性的 损失；称量药品时可稍稍过量。2、提取液及反应准备液配置：以下溶液 1-7d内可用，4C保存。1mol/L HCI (100ml): 8.333ml 浓 HCI 定容至 100ml。750mM(750mmol/L) H2Q (100ml): 7.570mL 30%HQ定容至 100m

2、l。500mM 2O2 (100ml): 5.0464mL 30%HC2定容至 100ml。10mM HG (100ml): 2mL 500mM 2O2定容至 100ml。（1）配置500ml提取液所需试剂药品如下:药品用量Tris3.0285gHCl(1mol/L)22.5ml甘油100mlEDTA （乙二胺四乙酸二钠）0.18612gAsA （抗坏血酸）0.08806gDTT（二硫苏糖醇）0.07713gGSH（谷胱甘肽）0.15366gMgC20.50825g蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCI和NaOH调节pH至7.0， 然后定容至500ml。（2） 500ml

3、A液配置所需试剂药品如下:药品用量Tris3.0285gHCl(1mol/L)22.5mlEDTA （乙二胺四乙酸二钠）0.18612g蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCI和NaOH调节pH至7.8， 然后定容至500ml。（3） 500ml B液配置所需试剂药品如下:药品用量Tris3.0285gHCI(1mol/L)22.5mlEDTA （乙二胺四乙酸二钠）0.18612g蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCI和NaOH调节pH至7.0， 然后定容至500ml。3、GPX反应液配置（100ml）:现用现配，24h内有效。反应液：111ul 容至10

4、0ml。愈创木酚用5ml乙醇溶解后加入1ml 500mM HQ,用B液定4、APX反应液配置（100ml）：现用现配，24h内有效。反应液：1ml 10mM HO用B液定容至100ml;30mM AsA 0.52836gAsA 用 B 液定容至 100ml。5、SOD反应液配置（100ml）:现用现配，24h内有效。反应液：0.0082gNBT和0.1995g蛋氨酸（甲硫氨酸）用 A液定容至100ml。0.1mM核黄素溶液：0.00376gVB2用A液定容至100ml。& CAT反应液配置（100ml）:直接使用B液即可。7、可溶性蛋白反应液:G-250考马斯亮蓝：100mg考马斯亮蓝

5、溶于50ml90%（ V/V）乙醇，加入85% （质量浓度）HPO100ml，再用蒸馏水定容至1000ml，常温下保存1个月。8、样品提取用长镊子取小麦整株地上部位迅速固定成长2-3cm的棒状并放入液氮中，直至取样过程结束后带回实验室-80 C下贮藏。提取时，从液氮中取出样品，待液氮挥发干净后迅速称量然后放入预冷的研 钵中磨碎后加入5ml提取液进一步充分研磨至匀浆，转移至10ml具塞刻度试管 中，并分2次冲洗，3000r/min离心15min后上清液定容至10ml,取2ml离心管 （每个重复2个）加入2ml上清液后12000r/min、4C离心20min, 4C保存（2 天内有效）。取上清液作

6、为酶提取液。9、酶活性测定：加入启动液摇匀后应立即放入分光光度计中进行测量。GPX酶活性:2.95ml 25 C预热后的反应液+50ul （自己摸索）酶液启动反应，测定OD7o；每隔30s读数一次，共测量180s，计算增加值。每个样品重复2次。CAT酶活性:2.9ml 25 C预热后的反应液（B液）+50ul酶液（自己摸索）+50ul 750mMHQ 启动反应，测定OD4o,用石英比色皿，每隔30s读数一次，共测量180s，计算 减少值。每个样品重复2次。APX酶活性:2.9ml 25C预热后的反应液+50ul酶液（自己摸索）+50ul AsA（30mM启动反 应，测定OB。，用石英比色皿,每

7、隔30s读数一次，共测量180s,计算减小值。 每个样品重复2次。SOD酶活性:1个暗中对照：2.9ml反应液+100ul核黄素;2个光下对照：2.9ml反应液+100ul核黄素;反应液2.85ml+50ul酶液（酶液量需要自己探索）+100ul核黄素，光下放置 1030min（时间如何确定：加入酶液的试管颜色深度是光下对照的一半左右为止； 时间必须记录下来，结果中需要用到反应时间），光照强度12000lx，以暗中对 照调零，OD560每个样品重复3次。Pro（可溶性蛋白）含量测定：反应液2.95ml+50ul酶液，25C反应5min,测 定OD595每个样品重复3次。10、结果计算（1） S

8、ODS活性计算，以抑制光化还原 50渐需酶量为1个酶活单位（U），公式如 下：so酶活性=VtX (ODk-OD)/ 0.5X OCk x Vt x WV 乂分别为提取液的总体积、测定时酶液用量；W为样品质量；ODk、OD代表光下对照的分光光度计值和样品管的分光光度计值。APX GPX SOD CAT酶活性计算，以每分钟降低 0.1OD值为一个酶活性单位 （U）,公式如下：酶活性：=(VtXA ODE)/(V t X t X WX 0.1)V W分别为提取液的总体积、测定时酶液用量； W为样品质量；a OD为测 定时OD值的改变量，t为OD值变化所花费的时间。GSH（谷光甘肽）、AsA （抗坏

9、血酸）、MDA（丙二醛）含量测定1. 提取液、反应液及缓冲液配制:500ml 5%的三氯乙酸（TCA： 25g三氯乙酸用蒸馏水定容至 500ml;200ml 10%的三氯乙酸：20g三氯乙酸用蒸馏水定容至200ml;200ml 44%的HPO: 103.5ml浓磷酸（85% 用蒸馏水定容至 200ml;500ml 150mM NaHPOpH=7.7) : 26.8605g Na2HPO加入 400ml 蒸馏水溶解后 调节pH,再用蒸馏水定容至500ml;200ml 150mM NaHPO(pH=7.4) : 4.6805g Naf PO加入 180ml 蒸馏水溶解后调 节pH,再用蒸馏水定容至

10、200ml;100ml 100mM磷酸缓冲液(PBS, pH=6.8): 1.7907g NazHP(4+0.6805g KH2PO 用90ml蒸馏水溶解后调节pH,再定容至100ml;100ml 3%的FeCl3： 3g FeCb用蒸馏水溶解后定容至100ml。10ml 4%勺2,2-二联吡啶：0.4g 2,2-二联吡啶加5ml乙醇溶解后用蒸馏水定 容至10ml;100ml 0.6%的硫代巴比妥酸：用5%的TCA加热溶解并用其定容至100ml。注：以上试剂常温下可放置一周。TDNB式剂：25.1mg TDNB用 pH6.8的磷酸缓冲液定容至10ml （用具塞刻度试 管即可），现用现配，4C保

11、存。2. 实验步骤:(1)提取：取样后迅速用液氮冰冻，用5ml 5% TCA+少许石英砂充分研磨后，再用5ml 5%TCA冲中洗入10ml离心管中，3000r/min离心15min,上清液定容至10ml，再吸取定容后的样液各1.5ml放入离心管中用于GSH和AsA含量的测 定，剩下的样液用于MDA含量的测定。(2) MDA含量测定:取4ml样品提取液+4ml 0.6%硫代巴比妥酸，沸水浴10min后离心取上清液 定容至8ml，测量其在450nm 532nm 620nm下的ODfi,每个样品测量三次。(3) GSH含量测定:300ul 5%TCA+300ul样液 +2.4ml H2O+2.8ml

12、 pH7.7 NaHP(4+0.2ml TDNB 30C 保温5min,每个样品重复三次，测定 ODb,调零管中的TDNB用 0.2ml pH6.8的 磷酸缓冲液代替参与上述过程。(4) AsA含量测定:500ul H 2O+3OOUI 样液 +400ul PH7.4 NaH 2PO,37 C 保温 30s 后再分别加入 800ul 10%TCA 44%HPO和 4%：联吡啶，40ul 3%FeCl3,然后 37C反应 60min, 测定OD25,三次重复，调零管加入300ul 5% TCA代替样品提取液参与上述过程。3.结果计算:MDA( umorgFW) = 8 X 6.45 X (OD3

13、2 OD00)-0.56 X OD50 X 2.5/(1000 X W)通过标准曲线查出对应 0D值的GSH和AsA含量，按照下式计算GSH和AsA含量。GSH(m?gFV-1)=CX VT/(V t X W)AsA(ug?gFV-1)=C X V/(V t X W)Vt、V分别代表提取液的总体积和参与反应中样液的体积；W为样品质量。可溶性总糖、可溶性还原糖含量测定1.试剂配制:500ml硫酸-蒽酮溶液：1g蒽酮+5g硫脲用体积比为76: 24 (硫酸：水)的 浓硫酸溶解，4C保存可用半个月；200ml 2mol/L NaOH : 16g NaOH溶解后定容至200ml，用塑料瓶盛放;3,5-

14、二硝基水杨酸：1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20ml 2mol/L NaOH加热溶解) 加入40ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至 500ml，转 移至试剂瓶中，盖好瓶塞，防止 CO进入；2. 实验步骤:(1)提取：从液氮中取出称重后，用3ml蒸馏水研磨至10ml玻璃试管中，再用4ml冲洗两次，煮沸20min,转移至离心管中(用3ml蒸馏水冲洗两次)，调 平后3000r/min离心15min,上清液定容至25ml；(2)还原糖含量测定:2ml 3,5-二硝基水杨酸+2ml提取液+4ml蒸馏水，沸水浴5min,调零管用水 代替提取液，测定OD4oo 总糖含量测定:2.9ml

15、硫酸-蒽酮溶液+100ul提取液，沸水浴10min,对照加水调零，测定：0oOD23. 结果计算:糖含量=CX VT/(V t X W)C是根据标准曲线对应OD值查出的糖含量，V W分别是提取液总体积和参 与反应的提取液体积，W是样品质量。四、脯氨酸含量测定1.试剂配制:500ml 2mol/L 的磷酸:67.57ml 85% HaPQ蒸馏水定容至 500ml;100ml酸性茚三酮试剂: 热溶解；2.5g茚三酮+60ml冰乙酸+40ml 2mol/L的磷酸，70E加100ml 3%磺基水杨酸:3g 5-磺基水杨酸用蒸馏水溶解后定容至 100ml;2.实验步骤:(1)提取：取样称量后用3ml 3%磺基水杨酸研磨，4ml冲