激活素a和卵泡抑素对冻融人胎儿卵巢雌二醇分泌的阻碍

1、池海虹，周颖，祝怀平，金畅，叶碧绿【关键词】激活素a；卵泡抑素；胎儿；卵巢；雌二醇abstract:objective:toinvestigatetheeffectofactivina-follistatinonsteroidogenesisoffrozen-thawedhumanfetalovaryinvitro.methods:thefrozen-thawedfetalovariantissuewasculturedindividuallyinminimalessentialmedium(mem)for8days.undertheexperimentalconditions,themedi

2、umwassupplementedwitheitheractivin-a(actagroup)orfollistatin(fsgroup)orthecombinationsofactivin-aandfollistatin(a+fgroup).theconcentrationofe2inculturedmediumwasdetectedwithimmunoluminescencemethod.results:thelevelsofe2at4thday,6thdayand8thdaywerehigherthanthatat2ndday(p,thesecretionofe2increasedatf

3、irst,thendecreasedwiththehighestlevelat6thday.thelevelofe2ofactagroupwassignificantlygreaterthanthatofthecontrolgroup,fsgroupanda+fgroup(p.conclusion:frozen-thawedhumanfetalovarycanexcreteestrodiolundertheconditionoftissueculture.actacanincreasetheexcretionofestrodiolincultivatedovariantissue,andthe

4、effectionofactacanbesuppressedbyfs.keywords:activina;follistatin;fetal;ovariantissue;estrodiol最近几年来发觉的一组性腺起源的细胞因子-激活素（activins），对卵泡发育有着重要的局部调剂作用，尤其是激活素a（activina，acta）。尽管有较多的研究说明了激活素对不同动物卵泡发育的阻碍1-3，但对人胎儿卵巢内卵泡发育的阻碍尚未见报导。本研究以胎儿卵巢为研究对象，比较acta和卵泡抑素（fs）在体外组织培育条件下对冻融人胎儿卵巢e2分泌的阻碍，探讨其在人卵泡发生进程中可能的调剂作用。1材料和方式

5、标本卵巢组织取自因打算生育或医疗缘故需行药物引产（利凡诺米菲司酮）的32周胎儿（温州医学院教学医院临盆室提供）共3例，于引产后2h内无菌条件下取材，置于预冷的leiboviz-15（l-15，美国sigma公司产品）基础培育液中待用。本研究经我院伦理委员会批准。试剂和仪器基础培育液为mem培育液（购自gibco公司），含5%小牛血清，100u/ml的fsh,100iu/ml青霉素和100iu/ml链霉素，1/100its（胰岛素-转铁蛋白-ft,insulin-transferrin-selenium）,ph。acta、fsh、fs均为sigma公司产品。e2测定采纳美国贝克曼库而特公司bxi

6、800仪器及试剂。实验方式冷冻及苏醒:将胎儿卵巢组织去除髓质及周围结缔组织后，切成5mrrX5mmX1mm大小，放入装有冷冻爱惜剂mol/l丙二醇（proh）的冷冻管中，依照oktay4提出的慢冻速融法处置。体外培育及分组:冻融卵巢皮质块切成2mmx2mmx1mm大小，随机放入加有ml培育液的24孔培育板内，37、5%co2培育箱内培育，隔天半量换液，共培育8d。实验共分四组：mem组（minimumessentialmedium，基础培育液）即对照组、acta组（基础培育液+100ng/mlacta）、fs组（基础培育液+100ng/mlfs）和a+f组（基础培育液+100ng/mlacta

7、+100ng/mlfs）；每组4块组织。所有实验重复3次。e2的测定:搜集培育2d、4d、6d、8d的培育液，采纳免疫发光法，按美国贝克曼库而特公司bxi800仪器及试剂说明测定e2的含量。质控符合要求,批内变异系数10%，批间变异系数15%。统计学处置方式采纳重复测量资料方差分析进行比较，采纳dunnet进行两两比较。2结果所有培育组的卵巢组织，培育4d、6d、8d分泌的e2值均高于2d值，不同有显著性（均p）,整体呈先增加后减少改变，在培育后6d可达较高水平；acta组e2分泌量明显高于对照组、fs组和a+f组，不同有显著性(均p),详见表1。3讨论胎儿卵巢组织体外培育条件下能分泌e2本实

8、验结果显示，胎儿卵巢组织在体外培育条件下能产生e2。目前，国内外对卵巢组织体外培育的最正确时刻尚无定论，除鼠卵巢组织外，其他哺乳动物的卵巢组织即便体外培育20d,组织内的低级卵泡也不能发育到次级卵泡时期5。本研究中e2分泌量随培育时刻延长先增加后减少，在培育后6d可达较高水平，这是不是提示人胎儿卵巢组织的体外最正确培育时刻为6d尚有待进一步研究。acta和fs对卵巢组织e2分泌的阻碍acta是最先在性腺发觉的糖蛋白激素，属于转化生长因子(transforminggrowthfactor,tgf)超家族成员。1986年第一次从猪的卵泡液中分离、纯化，依照其具有特异性地增进垂体细胞分泌、合成卵泡刺

9、激素(folliclestimulatinghormone，fsh)的生物学活性而得名6，要紧以旁分泌和自分泌途径发挥生物活性。目前的研究以为，acta是一种调剂组织细胞功能的大体介质，具有普遍的生物学活性，参与调剂颗粒细胞的增殖和分化、类固醇激素的产生7，支持卵泡生长并抑制卵泡闭锁8。最近几年来，在人卵泡颗粒细胞上也发觉了acta的受体9。本研究结果显示，acta对卵巢组织类固醇激素的分泌有增进作用，acta处置组的e2分泌量较对照组明显增加。其增进e2分泌的机制可能为，acta诱导卵泡颗粒细胞形态转变，并通过增加颗粒细胞上fsh的受体水平及结合位点，使fsh的生理作用增强10，后者能刺激芳

10、香化酶活性，增加e2的生成。fs是一种要紧由多种垂体细胞和卵巢颗粒细胞分泌的单聚体糖蛋白，1987年第一次从牛卵泡液中提掏出来，能抑制fsh分泌。在本实验中，fs组与对照组相较，e2分泌量无明显不同，说明fs单独利用未对卵巢e2的分泌产生阻碍。fs在结构上与acta无关联，但可通过与acta的不可逆结合，间接抑制颗粒细胞芳香化酶的活性、抑制垂体fsh分泌并下调未分化颗粒细胞fsh受体的表达，拮抗acta对卵泡的作用11。在对羊fs表达的研究中发觉，fs蛋白存在于羊原始卵泡的卵母细胞和低级、次级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中，但mrna仅在次级卵泡的颗粒细胞中检测到，因为fs结归并中和了act12，

11、这说明在初期卵泡发育中，fs可能调控了acta的生物活性。本实验结果显示，a+f组e2分泌量明显低于acta组，提示fs可能拮抗了acta对卵巢e2分泌的增进作用。朱辉等13在对离体大鼠卵泡体外培育实验中，也观看到相同的效应。【参考文献】1vanderhydenbc,macdonaldea,nagyovae,etal.evaluationofmembersofthetgf-betasuperfamilyascandidatesfortheoocytefactorsthatcontrolmousecumulusexpansionandsuppl,2003,61(1):55-70.2 calpmk

12、,matsumotoja,vanderkraakg.activinandtrans-forminggrowthfactor-betaaslocalregulatorsofovariansteroidogenesisinthegoldfishj.gencompendocrinol,2003,132(1):142-150.3 shidaifatf,khamasm,hailatn.activin-adifferentiallyregu-latessteroidogenesisbysheepgranulosacellsj.resvetsci,2001,71(1):23-25.4 oktayk,newt

13、onh,aubardy,etal.cryopreservationofimmaturehumanoocytesandovariantissue:anemergingtechnologyj.fertilsteril,1998,69(1):1-7.5 fortuneje,kitos,wandjisa,etal.activationofbovineandbaboonprimordialfolliclesinvitroj.theriogenology,1998,49(2):441-449.6 valew,rivierj,vaughanj,etal.purificationandcharacter-iz

14、ationofanfshreleasingproteinfromporcineovarianfollicularfluidj.nature,1986,321(6072):776-779.7 juengeljl,mcnattykp.theroleofproteinsofthetransforminggrowthfactor-Bsuperfamilyintheintraovarianregu-lationoffolliculardevelopmentj.humanreprodupdate,2005,11(2):144-161.8 matinsj,baynera,cambrayn,etal.expr

15、essionofactivinsubunitsandreceptorsinthedevelopinghumanovary:activinapromotesgermcellsurvivalandproliferationbeforeprimor-dialfollicleformation.j.devbiol,2004,266(2):334-345.9 silvajr,tharasanitt,tavernema,etal.theactivin-follistatinsystemandinvitroearlyfollicledevelopmentingoatsj.jendocrinol,2006,189(1):113-125.10 zhangyq,kanzakim,mashimah,etre-versestheeffectsofactivinaondnasynthesisandapoptosisinculturedrathepatocytesj.hepatology,1996,23(2):288-293.11linsy,morrisonjr,phillipsdj,etal.regulationofova-rianfunctionbythetgf-betasuperfamilyandfollistatinj.reproduction,