乙肝表面抗原检测操作规程

1、12乙型肝炎病毒表面抗原检测（ ELISA）1 原理：在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（HbsAb-HRP 及 TMB 等其它试剂，采用夹 心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。2 试剂：试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶 联免疫法）试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司 包装规格：96Test/Kit试剂盒组成： HbsAb 预包被微孔板（包被HbsAb），HbsAg 酶标抗体（含 HRP 标记 HbsAb） , HbsAg 阳性对照（含 基因工程 HbsAg，HbsAg 阴性对照（正常人血清），HbsAg 样 品稀释液（含

2、 BSA 缓冲液），浓缩洗涤液（PBS-T 缓冲液）， 底物 A（含H2O2,底物 B （含 TMB，终止液（含 H2SO4， 封板膜，自封袋，说明书。试剂储存条件及有效期：28C避光保存，有效12个月。3 样本采集：取静脉血 3-4ml 于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于4C冰箱保存，如长期保存需置于-15 至-20C冻存，并避免样本反复冻融。高脂血、高胆红素 及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。134 所需仪器全自动酶免分析仪 新鲜蒸馏水或去离子水酶标仪（单波长 450nm 或双波长 450nm/630nm） 微量移液器37C恒温箱或水浴箱洗板机或洗瓶5 检

3、验方法 平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（1825C）,微孔板板开圭寸后，余者即时以自圭寸袋圭寸存。配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分 溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按 1：19 稀释后使用。编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。 稀释：每孔加入 20ul 样品稀释液。 加样：分别在相应孔中加入 100ul 阴、阳性对照血清 或待测样本。温育：置 37C温育 60min。 加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体 50ul 。温育：置 37C温育 30min。 洗涤：用洗涤液充分洗涤 5 次、洗涤后扣干（每次应 保持 3060s 的浸泡时间） 。显色：每孔加入底物 A、

4、B 各 50ul，轻拍混匀，37C暗置30min 。终止：每孔加入终止液 50ul ，混匀。测定：用酶标仪单波长 450nm 或双波长 450nm/630nm测定各孔 0D 值（用单波长测定时，需用空白对照调零），并记录结果。6 结果判定与分析14临界值（）的计算：临界值=阴性对照孔 0D 平均值* ; 阴性对照 0D 均值小于时以计算。结果判定：样本 0D 值 S/.=1 者为 HbsAg 阳性 样本 0D 值S/.v1 者为 HbsAg 阴性 阴性对照均值 或阳性对照均值 时，实 验无效，应重新试验。7 质量控制每次试验用 HBsAg 的质控血清同步检测，S/CO 值应在控 制范围内；如失

5、控，检查试剂校期、储藏温度、试验温度是 否正常、操作步骤是否正确，直至从新试验使其在控。8 参考范围 阴性9 临床意义在血清或血浆中 HbsAg 的存在表明有急性乙肝或慢性 乙肝或为无症状携带者。10 操作性能 灵敏度为 ng/ml ，特异性高11 方法的局限性 此方法仅适用于个体的血清或血浆样本的检测，不适合与混合血清或血浆样本及其他体液样本。该方法仅作为定性检测乙型肝炎病毒表面抗原。试剂盒中的阳性对照不能作为灵敏度的考核指标，阳性对照仅用于按照说明书步骤操作时，验证试剂盒中的组分是否有效由于方法学的局限性，本实验结果仅作为判断疾病的 一项依据，如需对患者进行确诊，建议施于其它检验手段予 以

6、确认。12 注意事项15试验前请详细阅读试剂说明书，任何违反试剂说明书 的使用或操作行为，都可能得到不准确的结果。所有样本、试剂和各种废弃物应按传染物处理，严格 防止交叉感染，严格健全和执行消毒隔离制度。对于含有传 染病和怀疑含有传染源的物质，应有合适的生物安全保证制 度，下列为有关注意事项，但不仅限于此：1）戴手套处理样本和试剂；2）不要用嘴吸样；3 ）不可在处理这些物品时吸烟、进食、喝饮料、美 容和处理隐形眼镜等；4）用消毒剂对溅出的样本和试剂进行消毒；5 ）按科室有关条列来消毒和处理所有样本、试剂和 潜在的污染物。加试剂前应先将试剂瓶翻转数次，使液体混匀。建议 使用加液器进行加液，并经常

7、对加液器进行校准。加液时注 意勿使加液枪头接触孔内液体，避免液体间相互污染。仔细 操作，避免加样时在孔中产生气泡。每板设阴、阳性对照各两孔，设空白对照 1 孔，空白 对照不加样本和酶标抗体、其余各步相同。避免在孵育和保存过程中试剂被阳光暴晒和接触次 氯酸等强氧化性物质。孵育温度要保持在 37C+-1C，温度过高或者过低可能会影响检测结果的准确性。16封模板为一次性使用，重复使用可能导致污染。 洗板机在使用结束后要使用新鲜蒸馏水或高品质去 离子水冲洗干净，以防止管路堵塞和腐蚀。洗涤时各孔军需 加满但不溢出，防止孔内有残留物未能洗净。每次洗涤结束请尽早进行后续加液操作，避免长时间 暴露而引起错误结果。使用全自动生化仪器时，封板和洗版后扣干步骤可以 省略。但需要注意保证洗涤液的加液量，保证洗涤后将微孔 板孔中的洗液充分吸干，以免对实验造成错误的结果。确保反应孔板的底清洁干燥，在读板前要确保孔中液 体没有气泡。终止后尽早用酶标仪进行读数测量（建议在 10min 内 完成读值），避免放置过长时间而引起的错误结果。检测结果用酶标仪进行读数测量。样本的检测读数与 样本中抗原的浓度不一定呈正相关。检测结果呈阴性的样本，不能绝对保证样本中没有低浓度抗原的存在，不能完全排除HBV 感染的可能。该免疫测试不能绝对排除