《医学免疫学》elisa

1、.医学免疫学实验（三）免疫标记技术张蓓张蓓.检测检测Ag-Ab的体外实验的体外实验123凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应免疫标免疫标记技术记技术.标记免疫技术标记免疫技术=抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性特异性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术.常用的免疫标记物质常用的免疫标记物质类别 标记物 用途荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定化学发光物 Luminol、lucigenin

2、免疫分析测定金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定 .分分 类类免疫标记技术放射物标记技术免疫酶技术免疫酶技术免疫荧光技术免疫胶体金技术免疫胶体金技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法双抗体夹心法竞 争 法双抗原夹心法间 接 法双位一点法.l主要试剂主要试剂: : 酶标记的抗体或抗原酶标记的抗体或抗原l酶标物特点：酶标物特点： 免疫学活性免疫学活性 酶对底物的催化活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性酶高效催化反应的专一性ELISA ELISA 原理及特点原理及特点.特点：特点：灵敏度高、特异性强、灵敏度高、特异性强、准确性好准

3、确性好酶标记试剂能够较长时酶标记试剂能够较长时间保持稳定间保持稳定操作简便、对环境没有操作简便、对环境没有污染。污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的衍生出适用范围更广的新方法新方法。原理：原理：酶标抗体（抗原）与抗原酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析定性或定量的测定分析 原理及特点原理及特点.酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法（双位点一步双抗体夹心法（双位点一步法）测甲胎蛋白（法）测甲胎蛋白（AFP） .【临床意义】si

4、gnificance in clinical practise1 1、原发性肝癌的大规模、原发性肝癌的大规模普查普查 2、可以用作检测胎儿畸形和畸胎瘤.一、一、ELISA双抗体夹心法测双抗体夹心法测AFP原理原理l用抗用抗AFP抗体包被固相载体，加入待检标本，标抗体包被固相载体，加入待检标本，标本中的本中的AFP与固相载体上的抗体结合，再加入酶与固相载体上的抗体结合，再加入酶标记的抗标记的抗AFP抗体，形成抗体抗体，形成抗体-抗原抗原-酶标抗体复酶标抗体复合物，加底物显色，颜色的深浅与相应合物，加底物显色，颜色的深浅与相应AFP的量的量呈正相关。呈正相关。l双位点一步法：双位点一步法：包被抗体

5、包被抗体和和酶标抗体分别酶标抗体分别是抗是抗AFP不同位点的不同位点的McAb.ELISA原原理理图图【实验原理】【实验原理】Experiments mechanism.principleEAFPAb包被固相载包被固相载体体+S显色EE待测待测AFP抗抗AFP-E.抗抗AFPMcAb抗体抗体抗抗AFPMcAb抗体抗体AFP双位点一步法：抗双位点一步法：抗AFP不同位点的不同位点的McAb.二、试剂材料二、试剂材料1、AFP检测试剂盒检测试剂盒2、AFP参考标准液（参考标准液（0、25、50、100、200、400ng/ml）。）。3、DW4、终止液（、终止液（2M H2SO4）。）。5、酶标测

6、定仪、酶标测定仪、37温箱。温箱。6、微量加样器、滴管、吸水纸等。、微量加样器、滴管、吸水纸等。.三、method（一）（一）quantity test1 1、add sampleadd sample 取包被好的酶标孔取包被好的酶标孔7 7孔，进行标记，第孔，进行标记，第1 16 6孔分别加入孔分别加入AFPAFP参考标准夜（参考标准夜（0 0、2525、5050、100100、200200、400ng/ml400ng/ml）各）各10100ul0ul。第。第7 7孔加入样品孔加入样品10100ul0ul。37372020分钟分钟2 2、washwash：在各孔中加入洗液在各孔中加入洗液2 2

7、滴滴, ,轻轻摇动几下轻轻摇动几下, ,弃之弃之, ,然后然后用蒸馏水或自来水加满各孔用蒸馏水或自来水加满各孔, ,甩掉甩掉, ,反复反复5 5次次, ,最后在吸水纸最后在吸水纸上拍干上拍干. .3 3、每孔加酶结合物、每孔加酶结合物2 2滴，滴，37153715分钟。分钟。4 4、washwash5 5、显色、显色每孔加底物和显色液各每孔加底物和显色液各1 1滴，轻轻振摇，室温避光反应滴，轻轻振摇，室温避光反应5 5分钟，分钟，加入加入2 2滴终止液滴终止液终止反应。终止反应。5 5、酶标仪、酶标仪450nm450nm比色，计算结果。比色，计算结果。.（二）（二） quality test1

8、Add samplel取包被好的酶标板取包被好的酶标板3 3各孔，分别加入阴性对照（各孔，分别加入阴性对照（25 25 ng/mlng/ml）、阳性对照（）、阳性对照（400 ng/ml400 ng/ml）和待检标本各）和待检标本各10100ul 370ul 372020分钟。分钟。2 2、washwash：在各孔中加入洗液在各孔中加入洗液2 2滴滴, ,轻轻摇动几下轻轻摇动几下, ,弃弃之之, ,然后用蒸馏水或自来水加满各孔然后用蒸馏水或自来水加满各孔, ,甩掉甩掉, ,反复反复5 5次次, ,最后在吸水纸上拍干最后在吸水纸上拍干. .3 3、每孔加酶结合物、每孔加酶结合物2 2滴，滴，37

9、153715分钟。分钟。4 4、washwash5 5、显色、显色每孔加底物和显色液各每孔加底物和显色液各1 1滴，轻轻振摇，室温避光反滴，轻轻振摇，室温避光反应应5 5分钟，加入分钟，加入2 2滴终止液滴终止液终止反应。终止反应。.四、result 1Quantity testQuantity testl用酶标仪进行比色，以用酶标仪进行比色，以0 ng/ml0 ng/ml标准孔为空白孔，在波长标准孔为空白孔，在波长450nm450nm处分别读取各标准孔和样本孔处分别读取各标准孔和样本孔ODOD值，以值，以ODOD值为横坐标，值为横坐标，AFPAFP含量为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，

10、以测含量为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的定孔的ODOD值在标准曲线上查出相应标本的值在标准曲线上查出相应标本的AFPAFP含量。含量。 2 2Quality testQuality testl在白色背景上直接肉眼观察结果。阴性对照孔应基本无色，在白色背景上直接肉眼观察结果。阴性对照孔应基本无色，阳性对照孔呈深蓝色。若待检样品孔色泽深于阳性对照孔阳性对照孔呈深蓝色。若待检样品孔色泽深于阳性对照孔则则AFP400ng/mlAFP400ng/ml，阳性；若待检样品孔色泽深于阴性对照，阳性；若待检样品孔色泽深于阴性对照孔而浅于阳性对照孔则孔而浅于阳性对照孔则20ng/ml20ng/mlAFPAFP400ng/ml400ng/ml，弱阳性；，弱阳性；待检样品孔色泽浅于阴性对照孔则待检样品孔色泽浅于阴性对照孔则AFP AFP 20ng/ml20ng/ml，阴性。，阴性。l 参考范围：正常成人参考范围：正常成人AFPAFP含量含量20ng/ml20ng/ml。.【实验结果】Experiments resultsl若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为l若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定若待