酸中毒对胰岛素样生长因子及其结合蛋白的作用

1、    酸中毒对胰岛素样生长因子及其 结合蛋白的作用        【摘要】目的研究慢性代谢性酸中毒（CMA）对胰岛素样生长因子（IGF-1）及其结合蛋白（IGFBPs）的影响。方法采用Western ligand blot等方法，对随意进食组（AL）、尿毒症酸中毒组（UA）及其对照组尿毒症未合并酸中毒组（UB）、非尿毒症酸中毒组（CA）及其对照组无酸中毒（CNA）组的大白鼠进行了血清IGFBP-14的测定，对UA、UB组肝脏IGFBPs mRNA进行了测定。结果U

2、A的大白鼠每日身长增长（0.29±0.02）cm，食物身长效益为（0.22±0.01） mm/g，低于UB组（0.36±0.04） cm，（0.31±0.02） mm/g（P<0.01）；CA组的大白鼠每日身长增长(0.46±0.03) cm，食物身长效益为(0.41±0.02) mm/g，低于CNA组（0.64±0.02） cm，(0.55±0.02）mm/g（P<0.01）。UA组与UB组血清IGHBP-2的比值为0.61，CA组与CNA组的比值为0.57（P<0.05）；两对比组血清IGFB

3、P-1的比值分别为2.89倍、3.26倍（P<0.01）；肝脏的IGFBP-1 mRNA，在UA组为(1.21±0.46)Dens，在UB组为(0.92±0.16)Dens，IGFBP-2 mRNA，在UA组为(0.52±0.03) Dens，在UB组为(0.36±0.06)Dens(P<0.05)；各组间血清IGF-1差异无显著意义。结论(1)无论由尿毒症还是由非尿毒症因素引起的酸中毒血清IGFBP-2的降低，不是肝脏产生减少，而是代谢增强。（2）血清IGFBP-2降低与酸中毒的生长障碍有一定的关系。【关键词】酸中毒尿毒症胰岛素样生长因子胰

4、岛素样生长因子结合蛋白质类 Effect of acidosis on insulin-like growth factor-1 and its binding proteinsZHOU Xiang*, MANIAR S, KLEINKNECHT C. *Department of Pediatrics, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of chronic metabolic acidosis on insulin-like growth

5、factors-I (IGF-I) and IGF binding proteins (IGFBPs). MethodsUsing Western ligand blot technique, the authors measured plasma levels of IGFBP-1-4 in uremic acidotic rats (UA) and uremic but without acidotic rats (UB), in the non-uremic acidotic (CA) and pair-fed (CNA) rats and also delermined liver m

6、RNA in UA and UB rats. ResultsLength gain and length gain of food efficiency in UA rats were (0.29±0.02) cm/d and (0.22±0.01) mm/g, which were lower than those of UB (0.36±0.04) cm/d，(0.31±0.02) mm/g (P<0.01)； length gain and length gain of food efficiency (0.46±0.03) cm/

7、d and (0.41±0.02) mm/g in CA rats were also lower than those of CAN(0.64±0.02) cm/d，(0.55±0.02) mm/g (P<0.01). Plasma levels of IGFBP-2 in UA and CA were lower (0.61 UA vs UB, 0.57 CA vs CNA ) (P<0.05), but plasma IGFBP-1 (2.89 UA vs UB, 3.26 CA vs CAN) (P<0.01). Liver mRNA i

8、n UA was higher than that of their controls. Liver IGFBP-1 mRNA was (1.21±0.46) Dens in UA and (0.92±0.16) Dens in UB, liver IGFBP-2 mRNA was (0.52±0.03) Dens in UA and (0.36±0.06) Dens in UB(P<0.05)； Plasma level of IGF-I did not change as compared to their controls. Conclusi

9、on(1) CMA per se, whether induced by uremia or by non-uremic disorders, decreased plasma level of IGFBP-2,which was a result of enhanced IGFBP-2 catabolism instead of reduced production by the liver. (2) The reduced IGFBP-2 levels may be associated with growth retardation occuring in patients with C

10、MA.【Key words】UremiaAcidosisInsulin-like growth factorInsulin-like-growth-factors binding proteins生长障碍是肾小管酸中毒和慢性肾功能不全（CRF）的严重合并症，目前的研究涉及到生长激素系统1，对胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）的作用研究报道较少。本研究观察了尿毒症酸中毒和非尿毒症酸中毒时IGF-I和IGFBPs的改变，以进一步了解酸中毒对生长的影响。材料和方法一、实验对象选用法国幼年雌性Spraque-Darley大白鼠，体重约6070g。共60只，分为5组，每组12只，所有动物食用同样食

11、物。1.尿毒症合并酸中毒（UA）组：采用大部分肾切除术和30酪蛋白饮食制备成尿毒症合并酸中毒的动物模型。2.尿毒症未合并酸中毒（UB）组：仅在UA食物中加入碳酸氢钠（1.7 g/100 g食物）纠正其酸中毒，作为UA的对照组。3.随意进食（AL）组：采用假性肾切除术和随意30酪蛋白饮食，仅作为UA和UB的正常对照组。4.非尿毒症性酸中毒（CA）组：在食用水中加入3NH4Cl，制备成酸中毒的动物模型。5.无酸中毒对照(CNA)组：配对给予CA同样食物。实验中每日测定大白鼠体重和食物摄入量，实验前后测定2次身长（嘴与尾的长度）、血清pH值及碳酸氢盐（HCO-3）。实验20天，取血清冷冻于-20，用

12、于测定血清IGF-1和IGFBPs。杀死大白鼠快速取出肝组织速冻于液氮中，用于测定IGFBPs mRNA。二、实验方法1.采用放射免疫分析法测定血清IGF-1。2.采用Western ligand blot分析法测定血清IGFBP-3（分子量38 00043 000）和IGFBP-4（分子量24 000）2。将血清标本经12SDS聚丙乙烯凝胶电泳分析。然后电转移至醋酸纤维膜上（0.45 m，由法国Amersham公司提供）。再将其膜置于含有125I标记的IGF-1约810×105 Cpm的缓冲液中（由法国Amersham公司提供），4培养48小时，洗去未结合的125I-IGF-1，阴

13、干后，置-80放射自显影7天。X光片显示出38 00043 000带为IGFBP-3，24 000为IGFBP-4。3.进一步采用Immuno blot方法在28 00032 000区域分离IGFBP-2和IGFBP-1。将Ligand blot的纤维膜用含tween-20和5%脱脂奶粉的TBS缓冲液在室温下封闭3小时，再分别用抗牛IGFBP-2多克隆抗体（Code 06-107由法国 Euromedes公司提供）和抗人IGFBP-1抗体（由巴黎Binonx教授提供）培养1小时，然后用抗免疫球蛋白培养1小时，洗去多余抗体后，用LEC药盒显影（RPN.2109，由法国Amersham公司提供）。

14、4.采用Northern blot 分析测定肝脏IGFBPs mRNA3，首先从大白鼠肝脏抽取总RNA，并用1琼脂凝胶电泳分离，然后转移至尼龙膜上，进行预杂交后，然后分别用P32标记的IGFBP-1-cDNA、IGFBP-2-cDNA、IGFBP-4-cDNA（由荷兰鹿特丹Erasees大学Van Neck提供，）杂交过夜，经-80放射自显影48小时后显影。5.X光胶片上的显影带均采用密度测定仪进行定量测定。二、统计学分析一般营养及生化指标均采用Scheffer与各自的对照组相比较。血清IGFBPs用实验组和对照组的比值表示，以排除每次实验条件不同的差异，并以Sign检验分析。采用密度测定仪测

15、定所得的资料采用Sign检验分析。结果1.两酸中毒组（UA、CA）每只大白鼠的血清pH均<7.25，HCO-3<13 mmol/L。UB组pH为7.45±0.01，HCO-3为27.7±0.4 mmol/L。CNA组pH为7.41±0.01，HCO-3为23.3±0.5。2.表1所示各组食物摄入量及生长指标。两酸中毒组（UA、CA）的食物摄入量与其对照组相同，但身长增长和食物身长增长效益均明显低于其对照组（P<0.05）。血清IGF-1均无明显差别。表1各组大白鼠食物摄入量、食物效益、生长指标、血清IGF-1(±s)组别鼠数食

16、物摄入量(g/d)体重增长(g/d)身长增长(cm/d)食物体重效益(g/g)食物身长效益(mm/g)IGF-1(g/L)AL1220.03±0.668.78±0.330.58±0.030.44±0.030.29±0.02UA1212.90±0.545.06±0.310.29±0.02*0.39±0.020.22±0.01*267±35UB1211.32±0.584.69±0.500.36±0.040.40±0.040.31±0.022

17、56±24CA1211.39±0.574.79±0.370.46±0.03*0.43±0.020.41±0.02*451±27CNA1211.74±0.176.00±0.220.64±0.020.51±0.020.55±0.02437±31UA与UB，CA与CNA相比* P<0.053.表2所示两组酸中毒（UA、CA）血清IGFBPs与其对照组之比值，均表现为血清IGFBP-2下降，而IGFBP-1升高。IGFBP-3和IGFBP-4没有明显差别。表2各对比组

18、大白鼠血清IGFBPs的比值各组比鼠数IGFBP-1IGFBP-2IGFBP-3IGFBP-4UA/UB各122.89*0.61*1.120.95CA/CNA各123.26*0.57*1.210.92*P<0.01，* P<0.054.在尿毒症组，无论有无酸中毒UA、UB组，其肝脏IGFBP-1 mRNA和IGFBP-2mRNA表达组间差异无显著意义，但明显高于AL组（P<0.05），IGFBP-4降低，但差异无显著意义(表3)。表3各组大白鼠肝脏的IGFBPs mRNA表达(±s Dens)组别鼠数IGFBP-1IGFBP-2IGFBP-4UA61.21±

19、;0.46*0.52±0.03*0.85±0.21UB60.92±0.16*0.36±0.06*1.17±0.05AL60.32±0.090.11±0.121.46±0.24与AL组相比* P<0.05讨论由于营养和肾功能不全也可导致生长障碍，影响生长激素系统4，5。为显示酸中毒对生长和IGF-1的影响，本研究排除了营养和肾功能的影响，两组酸中毒共同表现为身长增长和食物身长增长效益的减少，血清IGFBP-1升高，IGFBP-2降低。尿毒症合并酸中毒的肝脏IGFBP-1和IGFBP-2mRNA表达均明显高于AL

20、组，UA与UB相比，并无差异。从而提示，酸中毒引起IGFBP-2降低，不是由于IGFBP-2在肝脏产生减少，而是IGFBP-2分解代谢增强，或者说这种IGFBP-2转录后的改变可能是由于IGFBP-2的降解增强。Jandziszak等6采用WLB方法测定酸中毒时IGFBP-2（32 00028 000区域）表达无明显改变，而本研究采用Immuno blot方法在分子量32 00028 000区域不仅分离出低水平的IGFBP-2,而且还有高水平的IGFBP-1。目前研究证实酸中毒常伴有蛋白代谢异常增加，而不改变蛋白合成，酸中毒严重程度与蛋白分解代谢有相关关系7，8，从而提示酸中毒的异常代谢可能直

21、接影响IGFBP-2正常代谢，但对IGFBP-3和IGFBP-4作用较小。尿毒症酸中毒（UA）也表现肝脏IGFBP-1和IGFBP-2 mRNA明显上升，以及血清IGFBP-1升高，与限制食物后的营养不良、禁食后以及糖尿病IGFBPs的变化相似4，提示酸中毒也可刺激肝脏合成IGFBP-1和IGFBP-2增加，而不影响IGFBP-1代谢。目前发现酸中毒可导致生长激素受体（GHR）和IGF-1血清水平和肝脏mRNA表达的降低9。本研究中，UA、UB组血清IGF-1高于AL组，但两组酸中毒与其对照组无明显差异，提示酸中毒对血清IGF-1无直接的影响。IGFBP-2大量存在于新出生大白鼠血液中，也有大

22、量的IGFBP-2在其肝、肾、肠局部组织表达，并随年龄的增长和IGFBP-3产生而逐渐减少10，提示IGFBP-2对生长以及局部组织和邻近组织细胞生长分化有着重要的作用，是重要的生长因子，也提示酸中毒对身长增长影响与IGFBP-2的关系。在尿毒症合并酸中毒时可导致生长激素依赖11，酸中毒引起IGFBP-1的升高、IGFBP-2的降低对IGF-1生物活性的影响也是值得研究的。经上所述，无论尿毒症还是非尿毒症因素引起的酸中毒，血清IGFBP-2的降低，不是肝脏产生减少，而是代谢增强。血清IGFBP-2降低与酸中毒的生长障碍有一定的关系。作者单位：100029 北京，中日友好医院儿科（周湘）；法国巴

23、黎BICHAT医学院肾生理室(MANIAR S、 KLEINKNECHT C)参考文献1Kuemmerle N, Kriey RJ, Latta K, et al. Growth hormone and insulin-like growth factor in non-uremic acidosis and uremic acidosis. Kidney Int, 1997, 51 (Suppl 58) :102-105.2Hossenlopp P, Seurin P, Segovia-Quinson B, et al. Analysis of serum insulin-like grow

24、th factor biding proteins using binding protein and competitive binding studies. Analy Biochem, 1986, 154:138-143.3Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid Guanidinium Thiocyanate-phenol-Chloroform extraction. Anal Biochem, 1986, 162:156-160.4周湘，Maniar S, Kleinknect C.食物对胰岛素样生长因子-I及其结合蛋白的影响.中日友好医院学报, 1997, 11:105-107.5Tonshoff B, Blum WF, Mehls O. Derangement of the somatotropic hormone axis in chronic renal failure. Kidney Int, 1997, 58 (Suppl):106-113.6Jandziszak K, Suarez C, Wasserman E，et al. Disturbances of growth hormo