硅酸盐细菌菌种

1、中华人民共和国农业行业标准                  NY 8822004     硅酸盐细菌菌种 Silicate-Dissolving Bacteria Culture  2005-01-04 发布         2005-02-01 实施   中华人民共和国农业部 

2、; 发布  前    言本标准的附录A、附录B、附录C、附录D和附录E为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出。本标准起草单位:农业部微生物肥料质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：曹凤明、李俊、沈德龙、姜昕、葛一凡。 硅酸盐细菌菌种1范围本标准规范了农用硅酸盐细菌菌种的特征、要求、检验方法、评价方法以及菌种的纯化、复壮和保藏。本标准适用于农用微生物菌剂和微生物肥料生产中使用的硅酸盐细菌菌种。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用

3、于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 17419-1998      含氨基酸叶面肥料 NY/T 301-1995        有机肥料速效钾的测定NY/T 798-2004        复合微生物肥料3术语硅酸盐细菌菌种 Silicate-Dissolving Bacteria Culture 是指一类在

4、土壤中能通过自身的生命活动，分解硅铝酸盐类矿物，释放钾素营养，改善植物的营养条件，并具备生产应用性能的细菌纯培养物。4菌种特征硅酸盐细菌菌种包括胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）和土壤芽孢杆菌（Bacillus edaphicus）两个种。4.1细胞形态营养体：粗长杆状，两端钝圆，革兰氏染色反应不定，产生聚-羟基丁酸盐（PHB）颗粒。在培养基A.1上(参见附录A)菌体大小为（1.01.2）×（2.57.0）m，菌体周围有厚荚膜。芽孢：壁厚，椭圆形，中生或近端生，芽孢囊不膨大或微膨大。4.2菌落形态在A.1培养基平板上：菌落圆形，无色，隆起，胶质粘稠，透明或半

5、透明，边缘整齐。4.3生物学特征好氧或兼性厌氧生长，水解淀粉，接触酶反应阳性，氧化酶和卵磷脂酶反应阴性，在无氮培养基（参见附录A.2）上生长良好，生长温度1045。5要求5.1 菌种要求纯培养物，无杂菌。5.2 硅酸盐细菌菌种技术指标见表1。表1     硅酸盐细菌菌种技术指标项  目指  标解钾能力-速效钾相对增加量，  %20发酵代谢产物植物激素总量，    mg/L1.0游离氨基酸总量，  mg/L50.0有机酸总量，     

6、mg/L500.0耐热能力-芽孢存活率，      %70发酵周期，         h606检验方法6.1菌种纯度检验在适宜培养基上培养，观察菌落和菌体形态，若有杂菌丢弃或对其进行纯化，纯化方法见 8.1.2  。6.2解钾能力的测定速效钾相对增加量的测定方法见附录B。6.3发酵代谢产物测定 6.3.1发酵条件在适宜培养条件下，发酵周期结束后取样测定发酵液中代谢产物的含量。以不接种的发酵培养液作对照。发酵培养基见附录A.3。6.3.2植物激素的测定见附录

7、C。6.3.3游离氨基酸的测定 见附录D。6.3.4有机酸的测定 见附录E。6.4芽孢存活率测定6.4.1测定方法菌悬液在65条件下恒温30min杀死营养体，制成芽孢悬液。芽孢悬液80恒温水浴处理10min，将处理前和处理后的芽孢悬液稀释涂布在适宜培养基上，适宜条件下培养2d4d，计菌落数。三次重复。活菌数测定方法应符合NY/T 798-2004中5.3.2的要求。6.4.2芽孢存活率计算按式(1)计算                &

8、#160;     (1)式中: - 芽孢存活率（% ）n0 - 处理前芽孢悬液的菌落平均数（cfu/mL）n1  - 处理后芽孢悬液的菌落平均数（cfu/mL）6.5发酵周期的检验适宜生产条件下，当发酵液中的菌体数量达到108cfu/mL以上且有80%以上的营养体形成芽孢为发酵周期终止。7评价方法7.1菌株符合表1中的各项指标，可以作为优良生产菌株。7.2表1中其他三项符合要求，而发酵代谢产物仅两项达到要求或其中一项达到要求的两倍，也可作为生产菌株。7.3当硅酸盐细菌菌种用做生产液体剂型时，对耐热能力不做要求。8菌种纯化、复壮和保藏

9、8.1菌种分离与纯化8.1.1分离将土壤或其他样品制成菌悬液，稀释后涂布A.1培养基平板上，适宜条件下培养2d4d，挑取符合硅酸盐细菌菌种特征的菌落进行纯化。8.1.2纯化在适宜的培养基上连续划线培养观察，直至菌落形态一致，镜检菌体大小整齐，无杂菌。根据硅酸盐细菌的特征进行菌种确认。8.2复壮菌种生长速度下降、菌体形态出现异常、主要功能指标下降时需要进行菌种复壮。具体操作方法是将菌种接种在适宜的土壤或载体中，也可将菌种转接在含有土壤浸出液的培养基上23代；培养一段时间后再分离，挑取与原菌种特征一致的菌落，纯化，同时按表5.1中的要求进行测试。8.3菌种保藏8.3.1短期保藏常用的保藏方法是斜面

10、保藏法，挑选菌苔丰满无污染的斜面菌种置于48下保存，三个月左右转接一次。8.3.2长期保藏 菌种形成芽孢后进行长期保存，采用两种或两种以上的方法保存，并制备多个备份。常采用的保藏方法有：冻干管法，甘油管法，石蜡油覆盖法，砂土管法等。      附录A（资料性附录）选择培养基A.1硅酸盐细菌培养基蔗糖5.0gNa2HPO42.0 gMgSO4 · 7H2O0.5 gCaCO30.1 gFeCl3 · 6 H2O5 mgpH7.58.5琼脂18.020.0 g蒸馏水1.0 LA.2无氮培养基（阿须贝（Ashby）培养基

11、）甘露醇10.0gKH2PO40.2gMgSO4· 7H2O0.2gNaCl0.2gCaCO35.0gCaSO4· 2H2O0.1gpH7.07.5琼脂18.020.0 g蒸馏水1.0 LA.3测定发酵代谢产物用发酵培养液玉米淀粉8.0g豆饼粉2.0 gK2HPO42.0gMgSO4 · 7H2O0.5gMnSO4 · H2O0.5 gCaCO30.1gFeCl3 · 6 H2O5 mgpH7.07.5蒸馏水1.0 L 附录B（资料附录）解钾能力测定B.1原理硅酸盐细菌能够分解硅铝酸盐矿物，将矿物态钾转变为可溶性钾为菌体自身或植物所利用，通过测

12、定培养液中速效钾含量的相对增加量来确定菌种的解钾能力。B.2材料和试剂B.2.1材料含钾矿石粉：钾长石，磨碎，粒径0.075mm以下。B.2.2试剂20% H2O2 溶液B.3培养液B.3.1种子液淀粉5.0g酵母膏1.0 gK2HPO42.0gMgSO4· 7H2O0.5gCaCO30.1gFeCl3 · 6 H2O5 mgpH7.58.5蒸馏水体积1.0 LB.3.2发酵液蔗糖10.0gMgSO4· 7H2O0.5g(NH4)2· SO40.2gNaCl0.1gCaCO30.1g钾长石粉5.0gpH7.27.5蒸馏水体积1.0 LB.4测定方法步骤B

13、.4.1钾矿石处理钾矿石粉用20%HCl溶液淋洗（酸洗，洗去速效钾和缓效钾），再用蒸馏水淋洗至中性。B.4.2种子液制备挑取一环活化好的斜面菌种接入50mL种子培养液中，150r/min 摇床，适宜温度下培养到对数期，菌体含量不少于2×108cfu/mL。B.4.3发酵液制备500mL三角瓶加入解钾发酵液95mL，高压灭菌备用。接入种子液5 mL，同时做加入等量灭活种子液的发酵液为对照，在28、150r/min条件下培养7d。设置三个重复。B.4.4发酵液的处理 过氧化氢灰化法将全部发酵液转入蒸发皿中，在水浴锅中浓缩至10mL左右，加2.0mLH2O2溶液，继续蒸发，并不断搅动，反复

14、加20%H2O2溶液几次至粘性物质完全消化。3500 r/min 离心10min，将上清液收集在50mL容量瓶中，用蒸馏水定容，然后测定溶液中速效钾含量。B.4.5速效钾的测定按 NY/T 301-1995 规定执行。对第6章试样的制备、第7章分析步骤中的7.1和7.3标准曲线绘制进行修改。B.4.5.1试样的制备 按 B.4.4 的要求执行。B.4.5.2分析步骤试样溶液制备 参见NY/T 301-1995 7.1，将称取试样5.00g 改为吸取试样5.00mL。吸取钾标准溶液 0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，7.50，10.00 mL分别置于8个50mL容量瓶中。加1

15、0.00mL 硝酸溶液，用水定容。此溶液1mL中含钾（K）0，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，15.00，20.00g的标准溶液系列。在火焰光度计上用空白溶液调节仪器零点，以标准溶液系列中的最高浓度的标准溶液调节仪器满刻度至80分度处，测量其他标准溶液，记录仪器示值。根据钾浓度和仪器示值绘制校准曲线或求出直线回归方程。B.5速效钾相对增加量按式（2）计算                  

16、0;   （2）式中：a  速效钾相对增加量（%）0 试样中速效钾的含量（mg/L）（未接种发酵液的对照）1 试样中速效钾的含量（mg/L）（接种发酵液） 附录C（资料性附录）发酵液中植物激素的测定C.1原理植物生长素赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）和细胞分裂素玉米素（Z）、异戊烯基腺嘌呤（IPA）等嘌呤衍生物都溶于甲醇，可用甲醇提取发酵液中的植物激素。植物生长素和细胞分裂素的分子结构不同，在反相C18柱上保留时间不同，调整流动相中各组分的比例，可使各组分定量分离。因此采用反相液相色谱法可对植物生长素和细胞分裂素定量测定。C.2试剂乙腈：色谱纯。甲醇：优级纯并

17、经0.5m滤膜过滤。植物激素标准品：色谱纯。磷酸：优级纯。水重蒸并经0.45m滤膜过滤。植物生长素标准溶液：分别称取植物生长素标准品(赤霉素GA3，吲哚乙酸IAA)各0.0020g（±0.0001），用甲醇溶解并定容至25.0mL；细胞分裂素标准溶液：分别称取细胞分裂素标准品（玉米素Z，异戊烯基腺嘌呤IPA等）各0.0040g（±0.0001）,用甲醇溶解并定容至25.0mL.C.3仪器高效液相色谱仪（HPLC），具紫外检测器。C.4测定方法C.4.1生长素C.4.1.1试样制备取10.00mL发酵液于50mL锥形瓶中，减压浓缩干后，加入50mL冷甲醇在5左右进行超声波中振

18、荡2h，经0.5m滤膜过滤，滤液待测。C.4.1.2色谱条件a.     色谱柱：C18, 0.4cm×25 cmb.     流动相：15%CH3CN40%CH3OH45%H2O（用H3PO4调pH至4.0）c.     检测器：UV254nm×0.1AUFSd.     进样量：10Le.     流速：0.7mL/minC.4.1.3标准样品测定在上述色谱条件下，吸取生长

19、素标样溶液10L进样分析，得到GA3、IAA色谱图，记录各组分保留时间和峰面积。重复进样三次，取各组分峰面积平均值。C.4.1.4试样溶液测定在同一色谱条件下，吸取试样溶液10L进行分析，以外标法计算样品中各组分含量。C.4.1.5计算外标法定量按（3）式计算               （3）式中：1 样品中生长素的总量（mg/L）i  样品中第i种生长素的含量（mg/L）V1   样品量（mL）V2   

20、; 样品定容体积（mL）C.4.2细胞分裂素的测定C.4.2.1试样制备按C.4.1.1 的规定执行。C.4.2.2色谱条件a.       色谱柱： C18, 0.4cm×25cmb.       流动相：15%CH3CN25%CH3OH60%H2O（用H3PO4调pH至3.5）c.       检测器：UV254nm×0.1AUFSd.     

21、;  进样量：20Le.       流速：0.7mL/min  C.4.2.3标准样品测定按C.4.1.3的规定执行。C.4.2.4试样溶液测定按C.4.1.4的规定执行。C.4.2.5计算外标法定量按（4）式计算                    （4）式中：2 样品中细胞分裂素的总量（mg/L）i  样品中第

22、i种细胞分裂素的含量（mg/L）V1   样品量（mL）V2    样品定容体积（mL）C.5植物激素的总量植物激素的总量为植物生长激素与细胞分裂素之和。按（5）式计算                      （5）式中：  植物激素的总量（mg/L）1 植物生长激素的总量（mg/L）2  细胞分裂素的总量（mg/L） 附录D

23、（资料性附录）发酵液中游离氨基酸的测定D.1原理试剂 仪器设备见 GB/T 17419-1998 4.1.1，4.1.2，4.1.3。D.2分析步骤D.2.1试样溶液的制备取试样（发酵液）2.0mL于10mL离心管中，加入5%磺基水杨酸钠2.0mL，混匀，放置1h，使蛋白质沉淀。再加入EDTA溶液1.0mL和盐酸溶液1.0mL，离心机离心15min，取上清液1.0mL于5mL的容量瓶中，蒸干，用1.0mL（pH2.2）的缓冲液溶解，待测。D.2.2试样空白溶液的制备空白试样溶液除不加试样外，用相同试剂溶液，按D.2.1 规定的步骤进行。D.2.3测定准确吸取0.20mL混合氨基酸标准液，用pH2.2的柠檬酸钠缓冲液稀释至适当浓度,作为上机测定的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定试样溶液氨基酸含量。D.2.4计算外标法定量按式（6）计算： 或     （6）式中： 样品中游离氨基酸总量（mg/L）ni 进样体积V3中第i种氨基酸的量（nmol）Mi 第i种氨基酸分子量mi 进样体积V3中第i种氨基酸的质量（ng）V1 样品量（mL）