酵母菌高密度发酵

1、酵母菌的高密度发酵酵母菌的高密度发酵发酵工程发酵工程课程设计第四组课程设计第四组 指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW（菌体干重）/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L的发酵方式。 高密度发酵可以提高发酵罐内的菌体密度，提高产物的细胞水平量，相应的减少了生物反应器（发酵罐）的体积，提高单位体积设备的生产能力，降低生物量的分离费用，缩短生产周期，从而达到降低生产成本，提高生产效率的作用。1.什么是什么是高密度发酵高密度发酵 首先首先,因为酵母菌生长繁殖快、代期短因为酵母菌生长繁殖快、代期短,生产生产蛋白的速率为动植物所不能蛋白的速率为动植物所不能比拟比拟 其次其次,酵母菌含有极丰富的

2、蛋白质酵母菌含有极丰富的蛋白质(45%至至56%),具有人体所必需的八种氨基酸和具有人体所必需的八种氨基酸和B族维生素族维生素,还还拥有丰富的酶系和多种经济价值很高的生理活拥有丰富的酶系和多种经济价值很高的生理活性物质性物质。 第三第三,酵母菌生产不受季节、气候和地区的酵母菌生产不受季节、气候和地区的限限制制 第四第四,酵母与其他微生物相比酵母与其他微生物相比,具有易于收集具有易于收集,代谢方式多样性代谢方式多样性,对环境的适应性较强和人们易对环境的适应性较强和人们易于接受等于接受等特性特性2.2.酵母菌在发酵工业方面的优势酵母菌在发酵工业方面的优势营养源营养源生长抑制性物质生长抑制性物质发酵

3、液流变学发酵液流变学3.3.限制酵母菌高密度发酵的因素限制酵母菌高密度发酵的因素 1. 1.营养源营养源 高密度高密度发酵的生物量达发酵的生物量达150g/L150g/L到到200g/L200g/L, ,需要投入需要投入2 2倍到倍到5 5倍于生物量的基质倍于生物量的基质, ,加上利用率加上利用率, ,实际用量远高实际用量远高于此值。于此值。如按葡萄糖计,酵母菌体得率在好氧条件下,葡萄糖的理论值是菌体的2倍,而实用为4倍到10倍;在厌氧条件下,理论值和实用值分别为9倍和60倍到80倍。根据米氏动力学理论,当营养增加到一定量时当营养增加到一定量时( (10ks10ks至至20ks20ks), )

4、,生长显示饱和型动力学生长显示饱和型动力学, ,进一步增加底进一步增加底物浓度物浓度, ,就可能发生一种基质抑制区就可能发生一种基质抑制区, ,表现为迟滞期延表现为迟滞期延长长, ,比生长速率下降比生长速率下降, ,菌体得率下降。菌体得率下降。对某些常用营养的极限指标是铵盐5g/L,磷酸盐10g/L,NaCl10g/L至20g/L,乙醇100g/L,葡萄糖100g/L。 由于氧气在纯水中溶解度很大氧气在纯水中溶解度很大,在培养基中在培养基中,溶解度更溶解度更低低,发酵液中达到30g/L,50g/L,150g/L,其需要使氧传递率分别为200mmpl/l.h,375mol/l.h和900mol/

5、l.h,而对现有生物反应器的氧传递速率上限为300mmol/l.h。因此,溶解氧的供给问题是一个关键限制因素。 酵母菌酵母菌在好氧发酵中在好氧发酵中,由于供氧不足、比生长速率由于供氧不足、比生长速率过大或碳源供给量高于酵母菌所能同化的速率过大或碳源供给量高于酵母菌所能同化的速率,就会就会产乙醇等代谢副产物产乙醇等代谢副产物,对菌体生长产生抑制对菌体生长产生抑制。尤其是高密度发酵,问题更为突出。CO2对菌体生长的影响对菌体生长的影响也不允忽视也不允忽视, ,一般发酵液中溶解一般发酵液中溶解7.04%就可抑制酵母就可抑制酵母菌的生长菌的生长,高于高于4%,生长生长下降。下降。发酵液中CO2的溶解度

6、应控制在1%至3%之间。但在大规模发酵罐中,CO2的影响将成为一个突出的问题。因为罐中CO2的分压是液体深度的函数,在罐压为0.2kg/cm2时,10m高的罐底部的CO2分压是端的CO2分压的2倍。2.生长抑制性物质 另外,在高密度大规模发酵中,大量泡沫的产生和不合理的使用消泡剂也会导致发酵失败。酵母菌在生产过程中,分泌一些蛋白质等表面性物质,这些物质被相间界面所吸附,导致液体表面张力降低,使单位体积中的相间界面积增大;但表面活性物质在相间界面上聚集,超过一定浓度时,使KL剧烈下降。菌体在高密度发酵时,耗氧速率剧增,更可能使发酵液内的溶氧降到临界浓度以下。此时,再加消泡剂或再补料,使溶氧浓度在

7、临界值以下停留了较长时间,导致菌体呼吸停止或厌氧发酵,并可能造成菌体自溶,产生大量蛋白质和核酸,形成乳化现象。若再加消泡剂就形成恶性循环。 一般发酵液视为拟均相,而在高密度发酵时,不能忽视菌体所占的体积,表现为气液固三相。另外,高密度发酵液的粘度也会大幅度增加,表现为非牛顿型流体,对氧的传递和营养物的传质都产生较大影响。3.发酵液流变学发酵方式的选择提高氧的供应方法防止乙醇的产生发酵液流变学4.4.高密度发酵的研究进展高密度发酵的研究进展 4.1发酵发酵方式的方式的选择选择 为了为了解决高浓度底物抑制解决高浓度底物抑制,补料分批发酵已被广泛地补料分批发酵已被广泛地应用各类微生物的高密度发酵应用

8、各类微生物的高密度发酵,如Suzuki等(1982年)采用流加所有养料的方法,使酵母菌体浓度可达150g/L以上。他们用多孔特氟隆管式传感器控制底物乙醇流加。使用质量平衡原理配制并流加复合无机盐溶液,其流加速度与乙醇和氨水的流加速度相配合。Mori等(1983年)对可同化乙醇的酵母采用补料分批、重复补料和连续发酵三种方式进行了比较,结果是补料分批发酵和重复补料分批发酵的菌体浓度均在150g/L以上,连续发酵的菌体浓度50g/L,而它们的生产率分别为6.97g/L.h.,10.9g/L.h.和10g/L.h.。因此,重复补料发酵是经济、有效的高密度发酵方式 4.2提提高氧的供应高氧的供应方法方法

9、 为了在高密度发酵过程中,保持一定的溶氧浓度,现在小型发酵罐中一般采用同纯氧混合通气来提高氧分压。由于使用纯氧不安全、不经济,同时在大规模发酵罐中可能局部混合不均,易使微生物产生氧中毒,反而抑制了菌体生长。最近已开发了多种提高氧供应的方法,如通过提高发酵罐的压力来提高氧的分压通过提高发酵罐的压力来提高氧的分压,ICI公司的压力循环罐已试验成功。在培养液中添加过在培养液中添加过氧化氢氧化氢,在细胞过氧化氢酶的作用下在细胞过氧化氢酶的作用下,释放出氧气释放出氧气,供菌供菌体体使用。使用。有人采用和小球藻混合培养方法,使藻细胞进行光合作用,所产生的氧气直接供菌体吸收。在培在培养基中添加血红蛋白或氟化

10、物乳剂养基中添加血红蛋白或氟化物乳剂,将其作为氧气载将其作为氧气载体体,提高培养基中氧的含量提高培养基中氧的含量,在培养基中添加在培养基中添加75%氟化氟化物乳剂物乳剂,发酵发酵24h,酵母菌体可达酵母菌体可达155g/L 4.34.3防止防止乙醇的乙醇的产生产生 早在巴斯德时代,人们已知道大量通风不产生乙醇,并且采用了补料技术(1915年)。但由于酵母菌的乙醇发酵酶系是组成酶,不受其他影响,而其呼吸酶系是阻遏酶系,受其他条件影响较大。Crabtrec效应就是指在高糖浓度下,即使在有氧条件下,使菌体由呼吸型向发酵型转变,也就是高速率同化葡萄糖而引起的好氧呼吸的阻遏作用。一般产生乙醇的条件是菌体比生长速率过高时,即使葡萄糖浓度保持在较低水平,酵母菌仍可转化为发酵性代谢,从而使菌体产量下降;或者供给糖量高于酵母菌所能同化的速率,即使供氧充分,仍然产生乙醇。为了防止乙醇产生,一般采用保持一定的比生长速率,采用补料技术,充分通风,使所产生的乙醇为酵母菌再利用。近年来兴起的生物反应和分离耦合技术在高密度发酵中的应用已取得了很大进展。乙醇作为副产物被在位分离出去。另外,对于CO2的有效去除,主要考虑设备选型和操作技巧问题。而消泡剂的