谷氨酸转运体在体外培养大鼠皮质星形胶质细胞机械性损伤中的表达变化

1、论著【收稿日期】2007-11-11;【修回日期】2008-03-05【作者简介】赵志勇(1976-,男,籍贯吉林双辽,主治医师,主要从事外科及医院管理工作。谷氨酸转运体在体外培养大鼠皮质星形胶质细胞机械性损伤中的表达变化赵志勇,刘芳,彭凤翔(武警四川总队医院,四川乐山,614000【文章编号】1008-5041(200804-0283-04【中图分类号】R745.7【文献标识码】A Glutamate transporters expression in cultured rat cortex astrocyte in vitro following me -chanical brain i

2、njuryZHA O Zhi -yong ,LIU Fang ,PENG Feng -xiang (Sichuan Provincial Corps Hospital of Chinese People s Armed Po -lice Force ,Leshan 614000,China 谷氨酸是中枢神经系统兴奋性突触传递的主要神经递质,其清除方式主要是通过谷氨酸转运体摄取谷氨酸。谷氨酸转运体分为GLAST (或简称EAAT1、G LT1(EAAT2、EAAC1(EAAT3、EAAT4和EAAT5等5个类型,主要位于神经元和胶质细胞的细胞膜上,能逆浓度梯度从胞外向胞内摄取谷氨酸,中止谷氨酸能

3、传递,使胞外谷氨酸浓度保持在较低水平,以保护神经元不受谷氨酸的毒性影响。近年来,研究发现中枢神经系统缺血损伤后,脑内神经元和星形胶质细胞胞膜谷氨酸转运体表达明显增加1,2,提示不同程度的脑损伤可引起脑内谷氨酸转运体的表达变化。以上是建立在化学性损伤的基础上,而对于与临床上脑损伤较为相似的机械性损伤后谷氨酸转运体的表达情况迄今未见报道。本实验通过建立体外培养大鼠皮质星形胶质细胞机械性损伤模型,研究单一细胞受到机械力损伤后谷氨酸转运体(EAAT1表达变化,并初步探讨其可能的机制,为临床颅脑损伤的防治提供理论依据。1材料与方法1材料1.2方法2.1星形胶质细胞鉴定GFAP 为星形胶质细胞特异性标志物

4、,存在于胞浆内,免疫组化染色呈棕黄色。对传代成熟的细胞进行免疫组化染色分析,置于镜下观察记数阳性细胞数,99%以上的细胞呈现棕黄色(DAB 显色,结果表明培养的细胞绝大多数属于星形胶质细胞(图1。 图1体外培养星形胶质细胞GF AP 免疫组织化学染色(X 2002.2流式细胞术检测EAAT1蛋白的表达流式细胞术定量分析结果表明:机械性划伤12h 和24h 后,EAAT1蛋白表达均较对照组显著增加(P 0.05。见表1。表1损伤不同时间后EAAT 1蛋白的表达情况( x s 组别EAAT1对照组0.420.09损伤12h 组0.830.13损伤24h 组0.890.11:与对照组比较,P 0.0

5、52.3Western blo tting 定量EAAT1蛋白的表达1:对照组;2:损伤后12h 组;3:损伤后24h 组图2对照组、损伤后12h 和24h 组谷氨酸转运体蛋白表达Western Blottin g 结果3讨论目前,国内外学者为了进一步阐明神经系统损伤的相关病理生理机制,研究临床颅脑损伤的防治方法,建立了多种以体外培养星形胶质细胞为基础的损伤模型,根据其致伤机理的不同大致可以分为两大类,即化学损伤和机械损伤模型。由于机械性损伤模型与临床上创伤性脑损伤发病机制最相似,故为我们所采用。机械性损伤模型可进一步分为牵拉损伤、液压冲击损伤、气压损伤及机械划伤模型等,各种类型的机械性损伤模

6、型具有各自优缺点,机械划伤无需特殊设备,操作简单,作用力单一,对细胞损伤较为明显,是一种简单有效的体外培养星形胶质细胞机械性损伤模型。星形胶质细胞的培养是基础与临床神经科学研究的基础,颅脑创伤的发生与发展,与脑内细胞的分子水平的变化是密不可分的。因此,研究星形胶质细胞受到机械力损伤后其细胞内分子表达的改变,对于探讨其致伤机理、指导临床诊断治疗具有一定的意义。国内外学者目前对于体外培养的星形胶质细胞的鉴定方法,多采用免疫组织化学的方法,根据细胞内特定的表达产物,应用最多的是神经纤维酸性蛋白(GFAP ,对细胞的种类进行区分。GFAP 是星形胶质细胞胞浆内特异性表达的一类蛋白质,在神经元胞浆内不表

7、达或很少表达,因此,通过免疫学方法,可对培养的星形胶质细胞的种类和纯度进行鉴别,以满足后续实验的需要,该种鉴定方法特异性强、操作简单,故为我们实验所采用。细胞发生损伤,其结果会导致细胞内(包括胞膜的结构和分子构成发生变化。研究发现以谷氨酸为主的兴奋性氨基酸在脑缺血损伤后的继发性损伤中起关键作用,大量兴奋性氨基酸聚积在细胞外间隙,最终导致神经细胞坏死或凋亡。谷氨酸转运体作为清除兴奋性氨基酸的最主要物质,当脑组织发生损伤后,随着大量氨基酸的形成,海马和皮质内的EAAT-1的表达在不同时间点呈现一种下降的趋势,结果表明谷氨酸转运体与缺血后神经功能缺损在时间上存在密切关联,神经细胞损伤以坏死为主,EA

8、AT-1的表达减少6。本实验以离体培养的星形胶质细胞为基础,采用机械力的方法导致脑细胞发生一定程度的损伤,结果显示在损伤后12h和24h,谷氨酸转运体的表达相比对照组明显升高,提示EAAT-1可能参与了细胞的抗损伤过程,在抵御谷氨酸对细胞毒性方面发挥了一定的作用。我们实验的结果与缺血性脑损伤存在一定的差异,原因可能与所采取的损伤模型不同,致伤程度不一致有关,其具体机理有待进一步研究7,8。【参考文献】1梁辉,陈虎,蔡定芳.急性脑缺血损伤大鼠海马神经元谷氨酸转运体的表达J.中国病理生理杂志,2005,21(6:1061 -1065.2张光运,段丽,饶志仁,等.局灶性脑梗死引起谷氨酸转运体在星形胶

9、质细胞的表达J.解剖学报,2004,35(6:574-577.3周洪语,路丽明,沈建康,等.SD大鼠星形胶质细胞的原代培养J.中华神经医学杂志,2003,2(5:346-348. 4阙海萍,贾宇峰,刘少君.神经元损伤修复机制研究的离体模型体外培养原代神经元损伤模型的建立及损伤后c-Fos蛋白表达J.军事医学科学院院刊,2003,27(4:277-279.5Kruger NJ.The Bradford method for p rotein quantitationJ.M ethods M ol Biol,1994,32:9-15.6邱永明,陆兆丰,田鑫,等.大鼠全脑缺血后谷氨酸转运体的表达J.

10、中国脑血管病杂志,2006,3(2:74-78.7Katsura M,Lino T,Kuriyama K.C hanges incontent of neu roac-tive amino acids and acetylcholine in the rat hippocampus foll ow ing trans iet forebrain ischemiaJ.Neurochem Int,1992,21:243-249.8Feustel PJ,Jin Y,Kimelberg HK.Volume-regulated anion chan-nels are the predominant co

11、ntributors to release of excitatory amino acids in the ischemic cortical penumb raJ.Stroke,2004,35: 1164-1168.(责任编辑:段姚尧(上接第282页等植物雌激素由于与雌二醇(es-tradiol的空间结构具有相似性,可以与雌激素受体(ER结合发挥微弱雌激素效应,也可与雌二醇竞争性结合ER,表现出雌激素拮抗作用。本研究表明,蛇床子素在10-8mol L时表现出明显的促进M CF-7细胞的增殖作用,提示在该浓度时蛇床子素对M CF-7细胞显示出雌激素样的刺激增殖活性。根据文献报道,蛇床子素具有

12、抗诱变3、抑制肿瘤增殖活性4,对人肺鳞癌和肺腺癌具有抑制作用5。本实验发现,在10-810-6mol L的浓度范围内,蛇床子素促MCF-7细胞增殖的活性随着浓度的增加而逐渐降低,推测可能与其本身具有的抗肿瘤作用有关。蛇床子素可能在低浓度时对M CF-7细胞显示出雌激素样的刺激增殖活性,随浓度的升高,其抑制肿瘤细胞增殖的活性逐渐显现出来。关于其在不同浓度时对乳腺癌细胞增殖作用的影响以及作用机制有待进一步探讨。【参考文献】1Zhang Y,Xie M L,Zhu LJ,et a l.Therapeu tic effect of ostholeon hyperlipidemic fatty liver in ratsJ.Acta Pharmacol Sin, 2007,28(3:398-403.2Robbl e Y K,Chen WF,Aling Dong,et a l.Estrogen-Like ac-tivity of gins enoside Rg1derived from Panax notoginsengJ.J Clin Endo&M eta,2002,87(8,3691-3695.3殷学军,向仁德,刘德祥,等.中药蛇床子水溶性提取物中化学成分的抗诱变性研究J.癌变畸变突变,1998,10(3: 133-140.4Kaw ai S,Tom ohiro N,Ogaw