褪黑素对乙醇致小鼠慢性肝损伤的保护作用

1、    作者：刘卫辉，蔡川，周扬，刘芳娥，田少华    【关键词】  褪黑激素；乙醇；肝/损伤；慢性病Hepatoprotective effect of melatonin on chronically ethanoltreated mice【Abstract】 AIM: To investigate the changes of alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), malondialdehyde (MDA) and pa

2、thological lesions of mice livers,which were caused by chronic alcohol drinking, and the protective effect of melatonin(MT) against ethanolinduced chronic  hepatotoxicity. METHODS: Fortyeight mice were randomly divided into 4 groups: control group(A), alcohol group , alcohol +high dosage M

3、T group(C), and alcohol+low dosage MT group(D). 60  mL/L alcohol was used to induce hepatotoxicity in these mice. MT was injected at 20 and 5 mg/kg immediately after alcohol drinking  in group C and group D respectively.  The activities of ALT, AST and the levels of

4、0; MDA in liver homogenate were detected. And pathological lesion in liver tissue was evaluated. RESULTS: MT inhibited the increasing tread of MDA in liver homogenate and lowered the levels of ALT and AST in chronically ethanoltreated mice. MDA: the content in group D and C was lower than that

5、of group B (P0.05);  ALT: the activity  in group D was lower than that of group B (P0.01), and  the activity  in group C was lower than that of group D (P0.01); AST: the activity  in group D was lower than that of group B (P0.01); the activity &

6、#160;in group C was lower than that of group D (P0.01). And in morphology MT could greatly prevent the lesions  of chronically ethanoltreated mice livers. Total pathological score: the score of group D was much lower than that of group B (P0.01); the score of group C was greatly lower than

7、 that of group D (P0.01).  CONCLUSION:  MT indeed hasa   protective effect on chronic ethanolinduced mice livers, which is positively associated with MT dosage.【Keywords】  melatonin,  ethanol liver/injuries; chronic disease【摘要】 目的： 探讨褪黑素(MT)对实验性慢性乙醇肝

8、损伤小鼠脂质过氧化、肝功能和肝脏病理组织的影响. 方法： 将48只小鼠随机分为4组： 对照组（A组），模型组（B组），造模+高浓度MT给药组（C组），造模+低浓度MT给药组（D组）. 用60 mL/L乙醇制成小鼠慢性肝损伤模型，测定肝组织中丙二醛(MDA)含量、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的活性，切片观察肝脏病理损害程度并评分. 结果： MT使慢性乙醇慢性肝损伤小鼠的MDA含量明显下降，有效降低AST和ALT活性，并与剂量呈正相关. MDA：造模+高浓度MT给药组和造模+低浓度MT给药组值均明显较模型组减低(P均0.05). ALT：造模+低浓度MT给药组活性值明显低于模型

9、组(P0.01)；造模+高浓度MT给药组活性值明显较造模+低浓度MT给药组减低(P0.01). AST：造模+低浓度MT给药组活性值明显低于模型组(P0.01)；造模+高浓度MT给药组活性值明显较造模+低浓度MT给药组减低(P0.01). 病理学形态观察显示，MT能减轻肝脏病理损害程度，与剂量成正相关.  病理损害程度评分： 造模+低浓度MT给药组值明显低于模型组(P0.01)；造模+高浓度MT给药组值明显较造模+低浓度MT给药组低(P0.01). 结论： MT对慢性乙醇肝损伤具有一定的保护作用，且与药物剂量呈正相关.【关键词】 褪黑激素；乙醇；肝/损伤；慢性病0引言嗜酒已

10、经是日益影响人类健康的严重问题1，正确认识和防治乙醇性肝病极为重要. 虽然急性乙醇中毒已有显效药物2，但是乙醇所致慢性肝脏损伤的有效治疗药物还很匮乏. 褪黑素(melatonin, MT）除了直接抗自由基3、抑制脂质过氧化反应外，还能增强体内抗氧化酶的活性，从而达到对自由基的杀灭能力4. MT在体内半衰期较短，主要代谢途径是经肝微粒体羟化酶催化生成6羟基褪黑素（6OH MT），6OH MT比MT有更强抗自由基作用5. 我们拟探讨MT对小鼠慢性乙醇肝损伤的保护作用，从而为乙醇致慢性肝脏损伤防治提供依据.1材料和方法1.1材料健康昆明小鼠8只，体质量1822 g，雌雄各半(第四军医大学实验动物中心

11、)；4 MT(1 g，纯度>99.5%，美国Sigma公司). 将MT溶解后加生理盐水稀释，配成浓度分别为10 g/L和2.5 g/L溶液，即配即用. 丙二醛(MDA)、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；二锅头白酒（北京二锅头酒厂）,产品标准号: Q大/EGT,6021996,一级,（乙醇浓度60度，V/V)；戊巴比妥，试剂为分析纯. DY89I型电动玻璃匀浆器（宁波新芝科器研究所）；MR1812离心机（美国Jouan公司）；紫外分光光度计（日本岛津，UV2100）；石蜡切片机；显微镜（日本Olympus公司BH2型）.1.2方法1.2.1

12、动物分组将小鼠随机分为4组： 对照组（A组），模型组（B组），造模+高浓度MT给药组（C组），造模+低浓度MT给药组（D组），每组l2只.1.2.2模型建立与给药A组生理盐水灌胃15 mL/(kgd);B组乙醇灌胃15 mL/(kgd) ，灌胃后1 h腹腔注射生理盐水2 mL/kg; C组乙醇灌胃15 mL/(kgd) ，灌胃后1 h腹腔注射MT 20 mg/kg; D组乙醇灌胃15 mL/(kgd) ，灌胃后1 h腹腔注射MT 5 mg/kg. 为造成慢性模型，乙醇最初稀释到浓度10度，以后每周提高10度，连续灌胃6 wk. 每日18:00点灌胃，19:00点腹腔注射MT，21:00点称体质

13、量.1.2.3指标测定1.2.3.1丙二醛(MDA)测定实验进行6 wk后，禁食12 h称各小鼠体质量,将小鼠颈椎脱臼法处死,迅速取出全肝,用0.9 mL/L的冰冷生理盐水洗去残存血迹,用滤纸吸干,称肝质量后取肝左叶留作冰冻切片，另取肝右叶组织剪成约5 mm×5 mm的小块,放入DY89I型电动玻璃匀浆器匀浆,制成组织匀浆液6,硫代巴比妥酸比色法7测定A532 nm值. SPSS12.0统计软件将A值转换为含量值表示肝脏过氧化程度,值越高表示肝脏过氧化程度越高8.1.2.3.2AST和ALT测定取上述组织匀浆液，硫代巴比妥酸比色法7测定A505 nm值. 通过对应标准曲线，应用SPS

14、S统计软件找到A505 nm值对应的酶活力单位7，值越高说明肝脏损伤越严重.1.2.4病理指标测定取肝脏左叶，冰冻切片，切片机作厚为5 m的切片,HE染色，请校病理学教研室，由专业人员进行Olympus BH2显微镜下观察评分，从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用40倍物镜连续记录70个视野(占整个的1/2). 观察指标为肝脂变、肝坏死、炎细胞浸润、纤维组织增生程度，4项之和为病理学总分. 其中，肝脂变、肝坏死、炎细胞浸润的评分为： 1分（微度），2分（轻度）,3分（中度）,4分（重度）. 肝脂变按照卫生部保健食品功效学评价标准评分. 微度： 肝细胞内含脂滴的肝细胞不超过1/4；轻度：含

15、脂滴的肝细胞不超过1/2；中度： 含脂滴的肝细胞不超过3/4；重度： 肝组织几乎被脂滴代替. 肝坏死和炎细胞浸润参照肝脂变评价标准. 纤维组织增生程度： 1分（未见纤维组织增生）；2分（少量纤维组织增生局限门管区内）；3分（大量纤维组织增生向门管区外延伸）；4分（纤维组织互相连接,假小叶形成）. 以病理评分表示肝脏过氧化程度,分值越高表示肝脏病理损害程度越高.统计学处理：  所有数据均以x±s表示，采用SPSS12.0统计软件，组间均数比较进行单因素方差分析，两组间比较采用LSDt检验，=0.05.2结果2.1肝脏大体观察B组肝脏颜色较A, C, D组明显灰暗，体

16、积大. B组平均肝脏质量为（2.0±0.2） g，A组 (1.7±0.4) g,二者差异显著（P0.01). C组 (1.8±0.4) g,与B组比差异明显(P0.05). D组的肝脏质量为(1.8±0.5） g,与C组比较无差异.2.2MT对MDA含量的影响B组MDA含量明显高于A组（P0.01，表1）； C，D组分别与B组比较差异显著（P0.05，表1）.2.3MT对AST和ALT活性的影响各组AST和ALT含量见表1. 各组之间两两比较均有显著差异（P0.01，表1）.表1各组MDA, ALT, AST指标变化（略）aP0.05 vs A; dP0

17、.01 vs B; fP0.01 vs C . A： 对照组；B：模型组；C：造模+高浓度MT给药组；D：造模+低浓度MT给药组.2.4MT对肝脏病理组织的影响B组各病理学指标得分明显高于A，C， D组（P0.01，表2）；在炎细胞浸润、纤维组织增生程度、病理总分指标中，C组与D组比较差异显著（P0.01，表2）.表2肝脏病理组织观察结果（略）bP0.01 vs A; dP0.01 vs B; fP0.01 vs C. A：对照组；B：模型组；C：造模+高浓度MT给药组；D：造模+低浓度MT给药组.3讨论实验结果表明，模型组的肝匀浆中MDA, ALT, AST含量高于对照组，表明造模成功. 造

18、模+高浓度MT给药组的MDA含量与ALT, AST活性明显低于模型组，表明造模+高浓度MT给药组的肝损伤程度明显较模型组减轻. 造模+低浓度MT给药组的MDA含量和活性明显低于模型组，表明造模+低浓度MT给药组的肝损伤程度明显较模型组轻微. 造模+高浓度MT给药组的ALT, AST活性明显低于造模+低浓度MT给药组，表明造模+高浓度MT给药组的肝损伤程度明显较造模+低浓度MT给药组轻微. 我们也连续观察了小鼠肝脏质量，发现造模+高浓度MT给药组和造模+低浓度MT给药组值明显低于模型组，说明MT能明显抑制小鼠肝脏肿大. 模型组的病理学指标的各分均显著高于对照组，也说明造模是成功的. 造模+低浓度

19、MT给药组的病理损害程度评分明显低于模型组，表明造模+低浓度MT给药组的肝病理损伤程度明显较模型组轻微. 造模+高浓度MT给药组的病理损害程度评分明显低于造模+低浓度MT给药组，表明造模+高浓度MT给药组的肝病理损伤程度明显较造模+低浓度MT给药组轻微. 实验显示： MT能使乙醇引起的小鼠慢性肝损伤的ALT，AST活性，MDA含量降低，病理学指标得分减少，保护程度与药物剂量成正相关.机体大量摄人乙醇后，在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化，使三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢，致使脂肪在肝细胞内沉积. 其次，乙醇能激活氧分子，产生自由基导致肝细胞膜的脂质过氧化及体内还原性谷胱甘肽的耗竭1

20、. 乙醇及其代谢产物丙二醛能够通过增加还原尼克酰胺腺二核甘酸、羟自由基、黄嘌呤氧化酶活性等引发脂质过氧化破坏氧化与抗氧化之间的动态平衡2，致使肝细胞凋亡. 可能机制主要有： 肝细胞色素P4502E1的活化；肝脏铁负荷增加；肿瘤坏死因子（TNF）和TNF受体的活性增高；促氧化物增多和抗氧化物减少造成的氧应激反应； ALD中肌纤维母细胞分泌的TGF9.由上可知，脂质过氧化作用是肝细胞结构损伤的重要因素；MT是一种抗氧化作用很强的物质，可以作用于这个环节，对肝脏起到有效保护作用. 一方面，MT6羟基MT可以直接对抗自由基的产生，造模+MT低剂量组MDA含量低于模型组正说明这一点；另一方面，MT和6羟

21、基MT可以提高抗氧化酶谷胱甘肽等的活性，并且延长这些抗氧化酶的作用时间，可能的机制是影响抗氧化酶的灭活. 肝细胞变性是乙醇性肝病常见的病变之一，其中脂肪变性最早出现. 过量乙醇蓄积消耗大量辅酶,干扰三羧酸循环和脂肪代谢,可导致肝脏的脂肪变性10. 乙醇中毒还能刺激贮脂细胞产生胶原和基质,这一变化是肝硬化的基础. MT能够抗氧化从而保护辅酶，阻止脂肪化的进程.【参考文献】1 范东晖. 酒与酒精肝J. 中国检验检疫，2004,14(12):64.2 Cheng J, Neil K. Hyperhomocysteinemia,endoplasmic reticulum stress and alcoholic liver injury J. World J Gastroenterol,