淋巴细胞分离

1、淋巴细胞的分离技术与培淋巴细胞的分离技术与培养养细胞分离原理与手段 基于对细胞物理特性 1 细胞比重差异（自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度法） 2 细胞的粘附性（贴壁细胞对玻璃、塑料器皿的粘附，B细胞对尼龙棉的粘附） 3 细胞对渗透压改变的敏感性（红细胞对低渗敏感，低渗处理，能使其裂解） 基于细胞表面的特异性标志物 1 补体细胞毒分离法 2 免疫磁珠分离法 3 流式细胞术血液细胞的组成及比重外周血红细胞红细胞粒细胞单个核细胞单个核细胞血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.0301.0351.0751.090(PBMC)1.092单个核细胞的特点 单核细胞：贴壁生长，能吞噬羟基铁粉 淋巴细

2、胞：悬浮生长 1 粘附力：B细胞尼龙棉 2 细胞表面标志物 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、CD25等 NK细胞：CD2、CD8、CD16、CD56等 淋巴细胞分离的流程密度梯度密度梯度离心法离心法粘附去除粘附去除改变细胞密改变细胞密度法度法E E花环分离法花环分离法尼龙棉分离法尼龙棉分离法流式细胞术流式细胞术磁珠分离法磁珠分离法单个核细胞的分离单个核细胞的分离 密度梯度离心密度梯度离心法法 原理： 外周血各种血细胞的比重不同，利用淋巴细胞分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于1.0751.092之间而近于等渗的溶液

3、（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。密度梯度离心法 FicollFicoll：1.0771.0770.0010.001 Percoll常用密度 20% 1.031 30% 1.043 40% 1.056 50% 1.067 60% 1.077 70% 1.090细胞细胞比重比重血小板血小板1.0301.0351.0301.035单个核细胞单个核细胞1.0751.0901.0751.090粒细胞粒细胞1.0921.092红细胞红细胞1.0931.093细胞比重细胞比重分层液比重分层液比重离心后离

4、心后PBMC红细胞粒细胞Ficoll/60% Percoll稀释外周血稀释的血浆的血浆、血小板、血小板Ficoll/60% Percoll实验步骤 1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入分层液，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）3. 20，1500r/min，离心30min4. 沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清7.适量的培养基重悬细胞 ，计数8.细胞活性检测淋巴细胞分离淋巴细胞分离 吸附法和改变细胞密度吸

5、附法和改变细胞密度法法单核细胞：贴壁生长，能吞噬羟基铁粉淋巴细胞不具有这些特点粘附去除法原理：单核细胞和粒细胞在37和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。方法：1、玻璃器皿吸附法 2 玻璃纤维柱法优点：简便易行，对细胞损伤极少。缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。改变细胞密度法原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。方法一：磁铁吸引法方法二：羟基铁-乳胶分层液法 T、B、NK细胞的分离细胞的分离T细胞能与细胞

6、能与STBC结合形成结合形成E花环花环E花环分离花环分离T细胞细胞B细胞对尼龙纤维特有的吸附能力细胞对尼龙纤维特有的吸附能力尼龙纤维分离尼龙纤维分离B细胞细胞淋巴细胞表面的标志差异淋巴细胞表面的标志差异免疫磁珠分离法与流式免疫磁珠分离法与流式细胞术细胞术E花环分离法原理： 人类T细胞表面上有能与绵羊红细胞相结合的受体（E受体，CD2）,能与经2-氨乙基异硫溴化物（AET）处理的绵羊红细胞结合，形成稳定的、细胞体积和比重较大的E花环。实验步骤1 AET-E花环实验：将分离的单个核细胞（20万/ml)与等量的1%AET-SRBC混合，37水浴15min,每5min摇匀一次，然后分装，每管23ml，

7、低速离心（1000r/min)5min后，4冰箱45分钟。2 T、B细胞分离： 淋巴细胞+SRBC悬液加入分层液T细胞形成E花环而沉于管底悬液中为B细胞。3 T细胞分离：取沉淀于管底的E花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3ml处理3s，低渗裂解E-花环周围SRBC，立即加3.5%NaCl溶液1ml，使还原为等渗，低速离心沉淀，即的富含T淋巴细胞群。试剂配制 AET溶液：称取AET粉剂402mg,溶于10ml去离子水中，用4mol/L NaOH溶液约910滴，调至pH9.0，用0.2m滤膜过滤除菌。用前临时配制。 AET-SRBC的制备： 1 SRBC中加等渗盐溶液（1:4）， 1800r/

8、min离心5min，连续洗涤5次 2 取压积的SRBC，加入新鲜配制的pH9.0的AET溶液（1:4），置37水浴15min，每隔5min摇匀一次。 3 加入预冷无菌等渗盐溶液，1800r/min离心5min，连续洗涤5次， 4 用含小牛血清的RPMI-1640液配成10% AET-SRBC悬液，置4保存，不得超过5天。使用时用10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释至1% ；原理： B细胞在37时易粘附于尼龙棉（聚酰胺）纤维上，而T细胞不具此能力。方法： 淋巴细胞通过聚酰胺纤维管洗脱下来的是T细胞。尼龙纤维分离法磁珠分离法 原理：1 磁性微珠，可结合不同的生物大分子物质（抗原、抗体、核酸

9、等）；2 在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。 以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。 基本步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。 方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离淋巴细胞的表面标志 CD抗原抗原 特特 异异 性性 CD2 E受体、全部T细胞和 部分NK细胞 CD3 成熟T细胞 CD4 Th细胞、M、HIV受体 CD8 Tc细胞、NK细胞的亚型

10、 CD25 IL-2受体、活化T细胞 CD16、CD56 NK细胞单克隆抗体单克隆抗体CD3羊抗鼠修羊抗鼠修饰磁球饰磁球Biomag抗抗CD3磁球磁球磁球结合磁球结合T细胞细胞加入加入B和和T细胞中细胞中负向选择负向选择正向选择正向选择磁架进行分离磁架进行分离直接法对细胞进行分类直接法对细胞进行分类间接法对间接法对T细胞进行分离细胞进行分离阳性分选阳性分选优优点：纯度高，点：纯度高，回收率高，回收率高，操作迅速、操作迅速、简便。简便。阴极分选阴极分选使用范围：使用范围：1 去除不需要的细胞去除不需要的细胞2 缺乏针对目的细胞缺乏针对目的细胞的特异性抗体的特异性抗体3不需要抗体和目的不需要抗体和

11、目的细胞结合细胞结合4复合分选的一部分复合分选的一部分 实用范围：主要用于细胞亚群的分选或者得到高纯度非常稀有的细胞。主要方式：1 去除后再阳性分选细胞亚群的分选，可以先磁性标记非目的细胞，去除分选后对阴性组分再行磁性标记和阳性分选。2 多重分选多次阳性分选根据多种表面标志磁性分选细胞复合分选 又叫荧光激活细胞分离法。原理： 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴(4000个/s)，每小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理

12、，分辨细胞的类型。流式细胞术激发系统激发系统细胞分选系统细胞分选系统荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法 检测与讯号处理系统检测与讯号处理系统细胞流动系统及气压流速控制系统细胞流动系统及气压流速控制系统操作方法 1. 将分离的单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1107 /ml； 2. 加适量荧光抗原（NK细胞特异性的抗原为CD16、CD56；T细胞CD3），4孵育30min，用RPMI-1640培养基洗2次； 3. 用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。总结 T细胞分离 1 E花环分离取沉淀，低渗裂解，洗涤 2

13、磁珠分离法或流式细胞术 B细胞分离 E 花环分离取上清，磁珠分离标记CD16或CD56 NK细胞分离 E花环取上清或尼龙纤维分离液，磁珠或流式细胞术分离 T细胞亚型分离T细胞分离的基础上，磁珠分离法或流式细胞术淋巴细胞淋巴细胞的培养淋巴细胞的培养淋巴细胞的保存淋巴细胞的保存（1）短期保存：用含有1020%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI 1640培养液可保存数周。（2）长期保存：在保护剂二甲基亚砜中于液氮（-196)中保存。其过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含有10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管内，4缓冲，-20结冰，转

14、移 -80过夜，继而进行降温(-196)冷冻。（3）复苏：将其从液氮中取出，立即放入40 温水中，融化后加入10倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。淋巴细胞的培养淋巴细胞的培养 培养条件： （1）无菌 （2）恒温：培养箱的温度应严格控制在370.5 （3）气体环境：02和C02 。大多数细胞的适宜pH为7.27.4。 （4）培养液： RPMI1640培养基、培养用无机盐、胎牛血清(FCS)、HEPES、肝素、淋巴细胞分离液、植物凝集素(PHA)和白细胞介素等。 操作步骤：1、洗涤 将收集到的淋巴细胞集中于离心管中用培养液洗涤两次，分别以2500和2000

15、rpm离心各10min，弃上清，之后进行接种。2、细胞接种 细胞接种通常是在无菌室超净工作台内的酒精灯火焰区进行。3、摇床培养 将接种后的培养瓶放于CO2培养箱中培养，条件为37、5%CO2、饱和湿度。从72h开始每48h添加等体积的新鲜培养液。 细胞活力的测定细胞活力的测定台盼蓝染色法台盼蓝染色法原理原理 常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞而使细故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞而使细胞着色（蓝色）胞着色（蓝色）步

16、骤：步骤：1、制备单细胞悬液。并作适当稀释、制备单细胞悬液。并作适当稀释(106 细胞细胞/ml)2、染色：细胞悬液与、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以台盼蓝溶液以9:1混合混匀。混合混匀。3、计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞结果统计：、计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞结果统计：镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。根据下式求细胞活力：根据下式求细胞活力：活细胞率活细胞率(%)= 活细胞总数活细胞总数/(活细胞总数活细胞总数+死细胞总数死细胞总数)100Thank youThank you FicollFic

17、oll：1.0771.0770.0010.001 Percoll常用密度 20% 1.031 30% 1.043 40% 1.056 50% 1.067 60% 1.077 70% 1.090细胞细胞比重比重血小板血小板1.0301.0351.0301.035单个核细胞单个核细胞1.0751.0901.0751.090粒细胞粒细胞1.0921.092红细胞红细胞1.0931.093细胞比重细胞比重分层液比重分层液比重粘附去除法原理：单核细胞和粒细胞在37和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。方法：1、玻璃器皿吸附法 2 玻璃纤维柱法优点：简便易行，对细胞损伤极少。缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。改变细胞密度法原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。方法一：磁铁吸引法方法二：羟基铁-乳胶分层液法 T、B、NK细胞的分离细胞的分离T细胞能与细胞能与STBC结合形成结合形成E花环花环E花环分离花环分离T细胞细胞B细胞对尼龙纤维特有的吸附能力细胞对尼龙纤维特有的吸附能力尼龙纤维分离尼龙纤维分离B细胞细胞淋巴细胞表面的标志差异淋巴细胞表面的标志差异免疫磁珠分