抗坏血酸衍生物对质粒DNA的氧化损伤：关于抗坏血酸的构效关系与其对质粒DNA的氧化损伤能力的初步

1、抗坏血酸衍生物对质粒DNA的氧化损伤：关于抗坏血酸的构效关系与其对质粒DNA的氧化损伤能力的初步研究刘培岩a，韦曦b，蒋宁c，林宏辉c*，余孝其a*四川大学化学学院，绿色化学与技术教育部重点实验室，成都 610064b中山大学光华口腔医学院附属口腔医院， 广州 510055c 四川大学生命科学学院，成都 610064摘 要：为了研究抗坏血酸氧化损伤质粒DNA的损伤机理，我们设计并合成了一系列不同羟基被封闭的抗坏血酸衍生物，研究了其对质粒DNA pUC19的氧化损伤作用。结果表明：分子中包含有未被封闭的2-OH和3-OH的衍生物，很好的保留了抗坏血酸氧化损伤质粒DNA的能力；2-OH和3-OH之

2、一被封闭的衍生物氧化损伤的能力被大大地削弱；而那些2-OH和3-OH都被封闭的衍生物，几乎完全丧失了氧化损伤质粒DNA的能力。本文还测定了这些衍生物产生的羟基自由基的量，得到的结果与电泳实验基本吻合。据此推断，2-OH和3-OH是抗坏血酸氧化损伤质粒DNA的主要活性位点。关键词：抗坏血酸衍生物，羟基自由基，质粒DNA，氧化损伤a1 引言在生命体系中，DNA是活性氧进攻的目标，尤其是羟基自由基(OH)13。活性氧的进攻，会导致DNA的损伤，包括单链损伤、双链损伤、释放自由碱基以及戊糖环的损伤等。DNA的损伤会导致生物体的老化、癌变等多种病变47。关于Fenton反应和类Fenton反应体系导致D

3、NA氧化损伤的研究，已经有很多相关报道了812。这些报道中，最常见的自由基是羟基自由基。由于抗坏血酸本身具有的重要的生理作用，所以抗坏血酸-过渡金属离子这一体系引起了我们的兴趣。众所周知，抗坏血酸是一个重要的抗氧化剂，可以直接清除活性氧，或者通过再生其它抗氧化剂间接地清除人体内的活性氧1。但是，在某些过渡金属离子存在等特定条件下，抗坏血酸也会表现出氧化剂的性质，损伤核酸等生物大分子1316。抗坏血酸分子中，存在四个羟基官能团，其中两个是烯醇。我们试图了解的一个重要问题是，在氧化损伤质粒DNA的过程中，究竟是哪个或哪些羟基官1能团是最重要的活性位点？关于抗坏血酸衍生物，已经有一些合成方面的报道。

4、并研究了其产Yamamoto等1718合成了6-O-酰基-2-O-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸，生羟基自由基的性质。Frimee19， Schmid20和Nihro21等人也合成了一系列抗坏血酸衍生物，并且研究了它们抑止脂质过氧化物等方面的生理性质。在这些研究里，大多数都表明抗坏血酸分子中的两个烯醇羟基在氧化损伤质粒DNA的过程中，有重要作用。然而目前还没有针对抗坏血酸分子中不同羟基被封闭的系列衍生物，对质粒DNA氧化损伤作用的对比这一方面的研究见诸报道。有鉴于此，本文设计并合成了一系列用简单烷基封闭了不同羟基的抗坏血酸衍生物，随后用这些衍生物进行对DNA的损伤实验和羟基自由基的测定，研究了抗坏

5、血酸分子中各个羟基对质粒DNA氧化损伤作用分别的贡献，初步研究了抗坏血酸对质粒DNA氧化损伤能力的构效关系。2 结果与讨论2.1 抗坏血酸衍生物的合成 HO6543抗坏血酸2图 1在抗坏血酸分子中，有四个羟基官能团，具有不同的活性（图1）。我们合成了一系列保护了不同羟基的衍生物，合成路线表示如图2。首先，用异丙叉基保护5-OH和6-OH，得到化合物1，并作为合成其他衍生物的起始原料。用硫酸二甲酯与化合物1反应，生成化合物2。除去异丙叉基，得到化合物3。由于1位羰基的吸电子作用，3-OH的活性较2-OH为高。所以可以通过控制加入硫酸二甲酯的量得到单甲基化产物化合物7，再除去异丙叉基得到化合物8。

6、为了2制备2-OH甲基化，3-OH不变的化合物5和化合物6，须先用甲氧甲基保护3-OH，再对2-OH进行保护，之后脱去保护基。甲氧甲基和异丙叉基可在同一步反应中去除，化合物5和6可同时得到。2.2质粒DNA的氧化损伤和羟基自由基的测定用琼脂糖电泳研究了这一系列的抗坏血酸衍生物对质粒DNA的氧化损伤作用，并测量了各个泳道的开链环状DNA所占质粒DNA总量的比例（图3）。在经过优化的条件下，抗坏血酸几乎可以将超螺旋DNA完全转化为开链环状（85.15%, lane 2）。相同条件下，化合物1可以将这一转化完成地更为彻底（100%, lane 3）。几个被封闭了一个烯醇的衍生物5，6，7和化合物8，

7、具有类似的氧化损伤能力，开链环状比例都在25%左右（lane 69）。5,6-OH上的异丙叉基对化合物5和7似乎没有影响。3-OH被封闭的化合物7和8对质粒DNA的氧化损伤能力较之2-OH被封闭的化合物5和6略强。两个烯醇都被封闭的化合物2和3几乎不能氧化损伤质粒DNA（0%, 0%, lane 4&5）。3ascorbic acid56图2 抗坏血酸衍生物的合成路线2.3 羟基自由基的测定用Halliwell的TBARS方法测定了抗坏血酸衍生物体系产生的羟基自由基22（图4）。相同条件下，抗坏血酸给出了比诸衍生物都要多的羟基自由基（4.945 nmol/L TBARS, Entry

8、1），化合物1也给出了大量的羟基自由基（3.932 nmol/L TBARS, Entry 2）。相比之下，化合物5、6、7和8给出的羟基自由基就少多了（分别为0.817, 0.205, 1.367, 0.131 nmol/L TBARS，Entries 58）。两个烯醇都被封闭的化合物2和3几乎不能产生羟基自由基（0, 0 nmol/L TBARS, Entries 3 & 4）。4A图 3B100plasmid relaxation (%)8060402023456789lane图3. 不同抗坏血酸衍生物导致质粒DNA氧化损伤 (A) pUC19 DNA经如下处理: lane 1:

9、 DNA 空白; lane 2: 抗坏血酸; lane 39: 抗坏血酸衍生物 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8; 各化合物浓度均为0.286 mM, Cu2+ 0.25 µM, 120 min, pH值7.4 (B) 开链比的测定432112345678TBARS(nmol/L)entry图4. 不同抗坏血酸衍生物产生羟基自由基的测定。 Entry 1:抗坏血酸; entries 28: 抗坏血酸衍生物 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8; 各化合物浓度均为0.286 mM, Cu2+ 0.25 µM, 120 min, pH值7.4。3 讨论从电泳实验的结果可

10、以发现，化合物1对质粒DNA的氧化损伤与抗坏血酸同样高效。可证明，抗坏血酸分子中的5-OH和6-OH对于氧化损伤并非必需。化合物5、6、7、8也可以氧化损伤DNA，但是程度弱得多。这就表明，被封闭了一个烯醇的衍生物只保留了一部分抗坏血酸的氧化损伤DNA的能力。化合物52和3不能氧化损伤DNA，这就指示我们，没有游离的烯醇的衍生物就没有氧化损伤DNA的活性。此外，3-OH被封闭的化合物7和8氧化损伤DNA的活性略高于2-OH被封闭的化合物5和6。这一结果表明2-OH和3-OH，尤其是2-OH，在抗坏血酸对质粒DNA的氧化损伤过程中起到至关重要的作用。从羟基自由基测定的结果中可以发现类似的趋势。具

11、有两个未被封闭的烯醇的衍生物给出最多的羟基自由基；只有一个未被封闭的烯醇的衍生物只能给出相对少量的羟基自由基；而两个烯醇均被封闭的衍生物不能给出羟基自由基。这些结果与琼脂糖电泳实验的结果联系起来（表1），可以表明，给出羟基自由基更多的抗坏血酸衍生物，便能够将更多的超螺旋DNA经单链损伤转化为开链环状。Compound Form II(%) TBARS（nmol/L）Ascorbic acid 85.2 4.9450 1 100 3.932 2 0 3 05 23.2 0.8176 20.9 0.2057 26.4 1.3678 27.0 0.131表1 不同抗坏血酸衍生物氧化损伤质粒DNA的开

12、链比与产生的羟基自由基4 实验部分4.1 仪器与药品抗坏血酸经去离子水重结晶。2-脱氧-D-核糖和硫代巴比妥酸购自Fluka公司。琼脂糖和pUC19质粒DNA购自Takara生物技术公司。TBARS的紫外吸收使用TU-1901紫外/可见分光光度计测定。实验中所使用ICP仪器为Thermo elemental公司的IRIS advantage型。电泳仪使用Biomeans公司的Stack II电泳系统，6PPSV-010。凝胶的拍照和泳道的扫描使用Olympus公司的Grab-IT 2.0 AnnotatingGC-MS数据Image Campture System。ESI-MS数据来自Finn

13、igan LCQDECA质谱仪。使用Agilent 6890-5973N质谱仪测定。HRMS数据由Bruker Daltonics Bio TOF质谱仪测定。1H NMR使用Varian INOVA-400 spectrometer (400MHz)测定。化学位移用(ppm)表示，耦合常数用Hertz (Hz)表示，内标为四甲基硅烷或氘代水。未经说明的化学药品均为直接购买，未经纯化直接使用。4.2 琼脂糖电泳实验pUC19质粒DNA在100mM磷酸混盐缓冲溶液中维持特定条件。低温中止反应。随后每个样品加入4微升上样缓冲溶液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）。1%的琼脂糖凝胶在TAE缓冲溶液中进行

14、电泳，溴乙锭加入胶中。照相，扫描。4.3羟基自由基的测定羟基自由基的测定，是通过对被羟基自由基氧化的脱氧核糖与硫代巴比妥酸随后加入生成的产物TBARS的测定来完的。脱氧核糖在特定体系中维持37 oC.，1%硫代巴比妥酸（w/v）和2.8%三氟乙酸（w/v）。加热至100 oC维持10分钟。冷却后测定532nm处吸收22。4.4 抗坏血酸衍生物的合成15,6-O-异丙叉-抗坏血酸（1）：文献方法合成23，白色固体，收率90%。H NMR(DMSO) 2CH(CH)O), 4.08-4.12 (m, 1H 22CH(O)CH), 4.72 (d, J = 2.8 Hz, 1H CH2+), HRM

15、S: found m/z = 239.0528 M + Na+, C9H12Na1O6 requires 239.0526。72,3-O-二甲基-5,6-异丙叉-抗坏血酸（2）：100ml圆底烧瓶内加入2.16克化合物1（10 mmol），溶于50ml丙酮，再加入3.86克K2CO3 （28 mmol）。在氮气保护下加入溶于5ml丙酮的2.27ml硫酸二甲酯（24 mmol）。回流4小时。固体过滤并以丙酮洗涤，滤液浓缩后，经柱层析分离（洗脱剂：石油醚（沸程60-90 oC）:1H NMR (CDCl3) 丙酮:乙酸乙酯10:1:1）可得到化合物2。白色固体，收率93%。: 1.35 (d, J

16、3), 3.81 (d, J3OC(C=O), 3.93-4.03, (m, 1H OCH2CH(O)CH), 4.09-4.11 (m, 1H OCH2CH(O)CH), 4.13 (d, J = 3.2 Hz, 3H 3OC(CH)=C), 4.24-4.28 (m, 1H CH2J = 2.8 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 267.0839 M + Na+, C11H16Na1O6 requires 267.0839。2,3-O-二甲基-抗坏血酸（3）：50ml圆底烧瓶中，加入1.22克化合物2（5 mmol），溶于25ml甲醇，再加入2N盐酸5ml，室

17、温搅拌过夜。减压蒸去溶剂，得黄色无定型固体，用乙酸乙酯/石油醚（沸程60-90 oC）重结晶可得化合物3。白色固体，收率62%。1H NMR (CDCl3) CH(OH)CH), 3.80 (s, 3H 3OC(C=O), 3.88-3.95 (m, 1H CH23OC(CH)=C),4.67 (d, J = 1.6 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 227.0526 M + Na+, C8H12Na1O6 requires 227.0526。3-O-甲氧甲基-5,6-异丙叉-抗坏血酸（4）：100ml三颈烧瓶中加入2.16克化合物1（10 mmol），溶于50m

18、l丙酮。加入2.07克K2CO3（15 mmol）。回流状态下，氮气保护下缓慢滴加溶于10ml丙酮的0.93ml甲氧甲基氯（11.6 mmol）。滴加完毕之后，继续回流搅拌4小时。固体过滤并以丙酮洗涤，滤液浓缩后，经柱层析分离（洗脱剂：石油醚（沸程60-90 oC）:丙酮:乙酸乙酯6:1:1）可得到化合物4。81白色固体，收率68%。H NMR (CDCl3) : 1.37 (d, J), 3.61 (s, 3H 3OCH222CH(O)CH),4.30-4.35 (m, 1H CH2J = 3.2 Hz, 1H CH2(s, 2H CH3O) , GC-MS (m/z) = 260 (M+)

19、。2-O-甲基-5,6-异丙叉-抗坏血酸（5）和2-O-甲基-抗坏血酸（6）：100ml圆底烧瓶内加入2.60克化合物4（10 mmol），溶于50ml丙酮，再加入2.07克K2CO3 （15 mmol）。在氮气保护下加入溶于5ml丙酮的1.14ml硫酸二甲酯（12 mmol）。回流4小时。减压蒸去滤液，得到黄色油状中间产物2-O-甲基3-O-甲氧甲基-5,6-异丙叉-抗坏血酸。加入30ml甲醇，将该中间产物溶解，再加入1N盐酸2ml，室温下搅拌25分钟。减压蒸去溶剂，得黄色油状液体，经柱层析分离（洗脱剂：石油醚（沸程60-90 oC）:丙酮:乙酸乙酯3:1:1）可得到化合物5（29%）和化合

20、物61H NMR (CDCl3) : 1.43 (d, J3), （32%）。均为白色固体。化合物5：3CH(O)CH), 4.16-4.20 (m, 1H 2CH(O)CH), 4.45-4.49 (m, 1H CH2J = 3.2 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 253.0692 M + Na+, C10H14Na1O6 requires 253.0683。化合物6：1H NMR (D2O) : 3.79-3.85 (m, 2H 2CH(OH)CH33OC(C=O) ), 4.11-4.15 (m, 1H CH2J = 2.0 Hz, 1H CH2+), H

21、RMS: found m/z = 213.0368 M + Na+, C7H10Na1O6 requires 213.0370。3-O-甲基-5,6-异丙叉-抗坏血酸（7）：100ml圆底烧瓶内加入2.16克化合物1（10 mmol），溶于50ml丙酮，再加入2.07克K2CO3 （15 mmol）。回流状态下，在氮气保护下缓慢滴加溶于10ml丙酮的1.14ml硫酸二甲酯（12 mmol）。回流49小时。固体过滤并以丙酮洗涤，滤液浓缩后，经柱层析分离（洗脱剂：石油醚（沸1:丙酮:乙酸乙酯6:1:1）可得到化合物7。白色固体，收率71%。H NMR 程60-90 oC）(CDCl3) : 1.3

22、7 (d, J2CH(O)CH), 2OC(CH)=C), 4.24-4.28, (m, 1H CH2J = 3.6 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 253.0670 M + Na+, C10H14Na1O6 requires 253.0683。3-O-甲基-抗坏血酸（8）：50ml圆底烧瓶中，加入1.15克化合物7（5 mmol），溶于25ml甲醇，再加入2N盐酸5ml，室温搅拌过夜。减压蒸去溶剂，得黄色无定型固体，用乙酸乙酯/石油醚（沸程60-90 oC）重结晶可得化合物3。白色固体，1H NMR (DMSO) 2CH(OH)CH), 3.62-3.65 (

23、m, 1H 收率58%。CH23OC(CH)=C), 4.75 (d, J = 1.6 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 191.0557 M + H, C7H11O6 requires 191.0550。致谢感谢国家自然科学基金（20132020，20372051，20471038）和教育部博士点专项基金，教育部新世纪优秀人才基金，四川省青年科技基金资助。10参考文献1. Halliwell, B., and Gutteridge, J. M. C. (1989) Free-radicals in biology and medicine 1st ed., pp

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