LPA抑制缺氧无血清诱导的大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的研究

1、LPA抑制缺氧无血清诱导的大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的研究1陈静海，徐瑞霞，邓琳子，朱伟铨，丛祥凤，胡盛寿，陈曦中国医学科学院心血管病研究所， 中国协和医科大学阜外心血管病医院，北京 (100037)E-mail：摘 要：本研究以缺氧/无血清条件模拟心梗后缺血微环境，观察溶血磷脂酸（LPA）抗MSCs凋亡作用。Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，并进一步采用Western blot方法检测LPA对Akt和ERK1/2的激活作用。结果表明：LPA对缺氧/无血清诱导的MSCs凋亡的抑制作用与阻止caspase-3的活化有关，并且其抗凋亡作用是通过激活PI3K/Akt和MEK/ERK1

2、/2通路实现的。关键词：骨髓间充质干细胞，缺氧/无血清，凋亡，LPA，Akt，ERK1. 引言随着冠心病发病率的逐年增高，缺血性心脏病已成为危害人类健康的重大疾病之一。缺血引起的心肌细胞死亡导致斑痕组织形成及心室壁顺应性降低，最终降低心功能引发心力衰竭。近年来，随着干细胞研究的兴起，骨髓间充质干细胞以其具有多向分化潜能、来源充足、体外易扩增、无免疫排异等优点，已经成为细胞移植治疗心肌梗塞的首选1,2。然而，移植细胞在缺血心肌组织中较低的存活率限制了此方法的临床治疗效果3。如何提高移植细胞的存活率，实现细胞再生、最终改善心功能，是目前细胞移植治疗缺血性心脏病亟待解决的问题。溶血磷脂酸（Lysop

3、hosphatidic Acid，LPA）是本课题组一直关注和研究的一种脂类信号分子，我们先前的研究发现LPA能够促进心肌细胞肥大4、对心脏成纤维细胞的生长具有双重调节作用5。那么，LPA是否能促进MSCs存活呢？本研究旨在以缺氧/无血清条件模拟缺血心肌微环境诱导MSCs凋亡6，深入探讨LPA是否能够抑制MSCs凋亡，从而为提高移植细胞的存活率、改善临床治疗效果提供实验依据和理论基础。2. 材料与方法2.1 实验材料SD 大鼠（SpragueDawley rats，二级动物），80g，雌性，购于北京大学医学部实验动物中心，所有研究都经阜外心血管病医院实验动物委员会批准。2.2 主要试剂及仪器L

4、PA和Hoechst 33342 购自SIGMA公司；特优级胎牛血清（FCS）、IMDM培养基、胰蛋白酶购自GIBCO公司；缺氧培养盒（hypoxic GENbox Jar）购自法国 BioMérieux®sa公司；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物公司。Caspase-3酶活检测试剂盒购自Bivision。 PD98059、U0126、LY294002、Wortmannin、Anti-phospho-Akt、Anti-Akt、 Anti-phospho-ERK和Anti-ERK均购自Cell Signal公司。CO2恒温细胞培养箱(Napco

5、 5410-220, USA)，荧光倒置显微镜（Olympus, JAPAN)，全1本课题得到2006年度教育部博士点基金资助项目（20050023016）的资助。-1-自动酶标分析仪 (Thermo electron corporation Multiskan MK3, USA)， 流式细胞仪（FACSC- LSR，Becton- Dickton，USA)。2.3 实验方法2.3.1 大鼠骨髓间质干细胞的分离(全骨髓法)动物腹腔麻醉。75%乙醇消毒。在超净台内分离腿部肌肉，取出股骨和胫骨。用PBS洗去残留血液， 剔除骨骼上残留的骨骼肌，除去长骨两端的软骨帽。轻轻刮去一层骨端的骨垢，用完全培养

6、液(含10%FCS的IMEM)缓慢冲出骨髓腔中的细胞，接种培养瓶。原代培养24 h后换液。45天后细胞可达到7080融合，以1：3传代。13代细胞用于实验。2.3.2 实验分组及处理正常对照组：以完全培养基培养（IMDM15FBS）正常培养；凋亡模型组：以无血清（IMDM）及缺氧处理（置于密闭缺氧罐中，内置耗氧剂），37 oC，5CO2孵育6小时；LPA处理组：以不同浓度的LPA（1、10和25µM）预处理MSCs 1小时，然后在缺氧无血清条件下继续孵育6小时。加抑制剂组：LPA预处理细胞之前加入MEK1/2抑制剂（PD98059或U0126）或PI3K抑制剂（LY294002或Wo

7、rtmannin）孵育1小时。2.3.3 AnnexinV/PI 双染流式细胞仪检测LPA或各种信号通路的抑制剂处理细胞后，取6×105 细胞，胰酶消化。1000rpm, 4,离心5 分钟，弃上清。细胞用PBS 洗2 次后悬浮于200µL binding buffer。加入10µL 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Annexin-（Annexin-FITC），轻轻混匀，4避光反应1520min。加入5µL PI , 300µL binding buffer，混匀，上流式细胞仪测试，以区分活细胞、早期和中晚期凋亡细胞及坏死细胞。2.3.4 Cas

8、pase-3活性的检测各组细胞经LPA处理结束后，收集细胞，提取蛋白，以考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。根据Caspase-3酶活检测试剂盒操作，使用酶标仪405nm波长测定Caspase-3活力。2.3.5 Western blot检测蛋白的表达各组细胞经LPA或各种信号通路的抑制剂处理后，收集细胞，提取蛋白，以考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。按50µg蛋白质量上样电泳，Western blot检测caspase-3活化片段、p-ERK和p-Akt的表达水平。3实验结果3.1 LPA抑制缺氧/无血清诱导的MSCs凋亡流式细胞仪检测：与凋亡模型组相比较，LPA（1、10和25µM）处理

9、组的细胞早期凋亡率（Annexin V/PI-）及中晚期凋亡率（Annexin V/PI）明显降低（P<0.05）。（图1）-2-图1 流式细胞术检测LPA的抗凋亡结果3.2 LPA抑制缺氧无血清导致的caspase-3的活化酶标仪测定caspase-3活力(OD405)，结果表明LPA（1、10和25µM）降低缺氧无血清诱导的caspase-3的活性。Western blot 检测caspase-3活化片段，结果显示，LPA（1、10和25µM）能明显减少活化片段的产生，与酶活力检测一致（图2）。-3-图2 A为LPA降低缺氧无血清导致caspase-3酶活性，B为

10、Western Blot方法检测LPA减少缺氧无血清导致的caspase-3活化片段的生成。3.3 PD98059或U0126抑制LPA的抗凋亡作用流式细胞仪检测结果显示，MEK抑制剂PD98059或U0126能明显抑制LPA的抗凋亡作用。Western blot结果说明LPA能够时间依赖性的激活ERK1/2：在5分钟时p-ERK表达开始升高，10分钟达到高峰，其后表达逐渐降低至基线水平。（图3）-4-图3 A为MEK抑制剂PD98059或U0126抑制LPA的抗凋亡作用,B为Western Blot方法检测LPA激活MEK/ERK1/2信号通路。3.4 LY294002或Wortmannin

11、抑制LPA的抗凋亡作用流式细胞仪检测结果显示，PI3K抑制剂LY294002或Wortmannin能明显抑制LPA的抗凋亡作用。Western blot结果说明LPA能够时间依赖性的激活Akt：在5分钟时p-Akt表达开始升高，60分钟达到高峰，其后表达逐渐降低。（图4）-5-图4 A为PI3K抑制剂LY294002或Wortmannin抑制LPA的抗凋亡作用,B为Western Blot方法检测LPA激活PI3K/Akt信号通路。4讨论LPA是结构最简单的磷脂信号分子，有多种生物学功能，能够抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡以及促进成纤维细胞的存活7,8。本课题组其它项目研究显示LPA对正常培养的大

12、鼠心脏成纤维细胞具有双向调节作用：既促进其增殖，同时又促进其凋亡5。新近实验研究观察到LPA可以抑制缺氧无血清诱导的MSCs凋亡，本文着重研究LPA抗MSCs凋亡作用的信号转导机制。Caspase-3在凋亡执行过程中起着关键作用。本实验结果显示，LPA能够降低缺氧无血清诱导的caspase3活性并较少Caspase-3活化片段的表达，进一步确认了LPA的抗凋亡作用是通过阻断caspase级联反应实现的。进一步的信号转导机制研究表明，LPA通过激活PI3K/Akt和MEK/ERK1/2细胞存活通路从而发挥其抗MSCs凋亡的作用。本研究结果还具有潜在的临床应用价值： 本课题组以往研究显示急性心梗患

13、者血清LPA水平显著升高9，因此选择合适的时间点进行MSCs移植，移植入的MSCs可以更有效的利用患者自身的内源性抗凋亡因子对抗缺血引起的凋亡。 MSCs移植前先以LPA预处理，激活促存活通路PI3K/Akt和ERK1/2，然后移植入心梗区可以提高其存活率。 MSCs移植同时注射LPA以提高微环境中LPA浓度，提高MSCs的存活。总之，本研究对于LPA抗MSCs凋亡作用及其信号转导机制的报道在国内外尚属首次，为提高移植MSCs的存活率、改善临床细胞移植治疗缺血性心脏病的疗效提供了新的思路，具有潜在的临床应用价值。-6-参考文献1 Keating A. Mesenchymal stromal c

14、ells.Curr Opin Hematol.2006,13:419-4252 Krampera M, et al. Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair.Bone. 2006, 39: 678-6833 Geng, Y.J. (). Molecular mechanisms for cardiovascular stem cell apoptosis and growth in thehearts with atherosclerotic coronary disease a

15、nd ischemic heart failure. Ann N Y AcadScience. 2003,1010: 687-97.4 Jinghai Chen, et al. Specific LPA receptor subtype mediation of LPA-induced hypertrophy of cardiac myocytes and involvement of Akt and NFB signal pathways. J Cell Biochem.已退修（稿号JCB-06-0862）5 Jinghai Chen, et al. Specific receptor su

16、btype mediation of LPA-induced dual effects in cardiac fibroblasts. FEBS Lett. 2006,580:4737-45.6 Zhu, W., et al. Hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells. Stem Cells. 2006, 24:416-25.7 Karliner, J.S., et al. The lysophospholipids sphingosine-1-phosphate and lysophos

17、phatidic acid enhance survival during hypoxia in neonatal rat cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 2001, 33:1713-7.8 Fang, X. et al. Lysophosphatidic acid prevents apoptosis in fibroblasts via G(i)-protein-mediated activation of mitogen-activated protein kinase. Biochem J. 2000, 352 Pt 1,135-43.9 X

18、 Chen, et al. Serum lysophosphatidic acid concentrations measured by dot immunogold filtration assay in patients with acute myocardial infarction.Scand J Clin Lab Invest. 2003,63: 497-503.Lysophosphatidic Acid Protects Mesenchymal Stem Cells against Hypoxia and Serum Deprivation-Induced Apoptosis Chen Jinghai, Xu Ruixia, Deng Linzi, Zhu Weiquan, Cong Xiangfeng, Hu Shengshou,Chen XiCardiovascular Institute and Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Science & PekingUnion Medical College, Beijing, China (100037)AbstractTo investigate whether Lysophosphatidic A