水中大肠杆菌的检测方法

1、word完美格式附件水中大肠杆菌群检测方法多管发酵法NIEA E201.54B一、方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）表示 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。二、适用范围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。三、干扰(一)水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。(二)检测使用的玻璃器皿及

2、设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。四、设备(一)量筒：100至1000 mL之量筒。(二)吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。(三)试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。(四)发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。(五)稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。(六)锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。(七)采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。(八)冰箱：温度能保持在4 &#

3、177; 2者。(九)天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。(十)培养箱：温度能保持在35 ± 1者。(十一)高压灭菌釜：温度能维持在 121（压力约15 lb/in2 或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。(十二)高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在 160达2小时或170达1小时以上者。(十三)接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。(十四)pH计：精确度达0.1 pH单位。五、试剂(一)试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在 25 时小于2 mho / c

4、m（S / cm）。(二)培养基，应使用市售商品化培养基。、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST） 1倍浓度LST培养基含有下列成份：胰化蛋白胨（Tryptose）20.0g乳糖（Lactose）5.0g氯化钠（NaCl）5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate）0.1g试剂水1L配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后

5、培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。、煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliant green lactose bile broth，简称BGLB） 1公升的BGLB 培养基中含有下列成份：蛋白胨（Peptone）10.0g乳糖（Lactose）10.0g牛胆粉（Oxgall Powder）20.0g煌绿色试剂（Brilliant Green）0.0133g试剂水1L取40 g BGLB培养基粉末溶于1 L试剂水，完全溶解后，分取5至10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经12

6、1灭菌15分钟，冷却后备用，其pH值应在7.2 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。(三)无菌稀释液、磷酸二氢钾储备溶液取3.4 g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于50 mL的试剂水中，俟完全溶解后，以1.0 N NaOH 溶液调节其pH值为7.2 ±0.1，然后加试剂水至100 mL，灭菌（过滤灭菌或121 高温高压灭菌15分钟）后储存于冰箱中备用。4 ± 2 下保存期限为3个月。 、氯化镁储备溶液取8.1 g氯化镁（MgCl26H2O），先溶于少量试剂水，俟完全溶解后，再加试剂

7、水至全量为100 mL，灭菌（过滤灭菌或121高温高压灭菌15分钟）后，储存于冰箱中备用。4 ± 2 下保存期限为3个月。 、无菌稀释液 分别取10 mL氯化镁储备溶液和2.5 mL磷酸二氢钾储备溶液再加入试剂水至2,000 mL，混摇均匀后，分装于稀释瓶中，经121灭菌15分钟，作为无菌稀释液备用。如欲用于水样稀释，分装之无菌稀释液灭菌后体积须为90 ± 2.0 mL。4 ± 2 下保存期限为3个月。 六、采样与保存 (一)盛装水样检验微生物之容器，应使用清洁并经灭菌之玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌采样袋，且于采样时应避免受到污染。水样若含有余氯时，无

8、菌容器中应加入适量之无菌硫代硫酸钠（采取加氯之废水时，每100 mL水样中加入0.1 mL、10%硫代硫酸钠可还原15 mg/L余氯。采取含氯之饮用水水样时，每100 mL之水样如加入0.1 mL之3%硫代硫酸钠，可中和之余氯量约为5 mg / L。）。(二)采样前应清洁手部，再行采水样，所采水样应具有代表性。(三)运送时水样温度应维持在小于10 且不得冻结，而实验室内保存温度应维持在4 ± 2 。(四)水样应于采样后24小时内完成推定实验之水样添加步骤（七、步骤(一)、），并置入培养箱中培养。(五)水样量须以能做完所需检验为度，但不得少于120 mL。七、步骤试验分两阶段进行。首先

9、进行推定试验，若推定试验结果为阳性反应，则继续进行第二阶段之确定试验，如结果仍是阳性反应则显示有大肠杆菌群存在。各试验步骤如下述：(一)推定试验、慎选发酵管中没有气泡且未污染之10 mL、2倍浓度LST试管。、水样在进行检测或稀释之前必须剧烈摇晃25次以上，以使样品充分混摇均匀。、视水样中微生物可能浓度范围进行水样稀释步骤，使用无菌吸管吸取10 mL水样至90 mL无菌稀释液中，形成10倍稀释度水样，混合均匀，而后自10倍稀释度水样以相同操作方式进行一系列适当之100、1000、10000倍等稀释水样，进行稀释步骤时，均需更换无菌稀释吸管，水样稀释步骤如图一所示（注1）。、以无菌吸管分别取各稀

10、释度10 mL水样至内含10 mL 2倍浓度的LST试管中，每一稀释度各作5支，小心混合均匀，混合后发酵管内不可产生气泡。、在35 ± 1培养箱中培养48 ± 3小时，观察并记录发酵情形，若有气体产生则推定试验为阳性反应，若无气体产生则推定试验为阴性反应，但若培养液呈混浊状态，虽无产气，亦应进行确定试验。(二)确定试验若推定试验之发酵管中有气体或混浊产生时，则使用BGLB进行确定试验：、慎选发酵管中没有气泡且未污染之BGLB试管。、利用无菌接种环自产生气体以及混浊之LST培养基试管中，接种一圈培养液至BGLB培养基试管中。、在35 ± 1培养箱中培养48 

11、7; 3小时。、在48 ± 3小时内，BGLB 培养基试管如有气体产生，则确定试验为阳性反应。八、结果处理(一)经确定试验确认BGLB试管为阳性反应后，应以100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）计算及记录。5支发酵管连续三种稀释度之MPN可查表一。(二)表一所示接种之水样量为10 mL、1.0 mL 及0.1 mL，若所用之稀释度有三种以上时，采用最具意义之三种稀释度，查表后再计算100 mL水中大肠杆菌群最大可能数。稀释度之选取方式如下：、先选取5管均呈阳性反应的最高稀释度（此时稀释度较低之各组试管必须全部呈阳性反应），再选取下两个稀释度（如表二水样别a）。、如果稀释度

12、最低的一组并非5管均呈阳性反应，则选取稀释度最低的一组，再选取下两个稀释度（如表二水样别b、c）。、如果依据上述原则（、及、）选取3个稀释度后，下一稀释度试管组仍有阳性反应试管，则舍弃原先3组中稀释度最低的一组，纳入下一稀释度的数据（如表二水样别d）。、如果依据上述原则（、至、）选取3个稀释度后，更高稀释度之试管组仍有阳性反应试管，则把更高稀释度之阳性反应试管数加至原先3组中稀释度最高的一组（如表二水样别e）。(三)100 mL水中大肠杆菌群最大可能数（MPN/100 mL）之计算公式如下： 结果小于100时，以整数表示（小数字数四舍五入），菌落数大于100以上时，只取两位有效数字：例如110

13、以1.1 × 102表示，16,000以1.6 × 104表示。(四)检测纪录须注明采样时间、培养起始及终了时间、培养基名称、培养温度及各稀释度的数据等相关数据。九、质量管理(一)微生物采样人员及检测人员应具备微生物基本训练及知识。(二)每批次采样时应进行运送空白。(三)每批次或每10个水样需进行试剂空白实验。 (四)新购入之培养基，每批号均须以大肠杆菌群阳性控制菌株（如E. coli、Enterobacter aerogenes、Citrobacter freundii）进行测试，以确保数据质量。(五)若一季期间水样均未检出大肠杆菌群，则须以大肠杆菌群菌株进行培

14、养基测试，以确保数据质量。(六)本方法培养所得之细菌可能具有感染性，检测后之培养基及器皿应经高温高压灭菌处理。十、精密度及准确度略十一、参考数据 (一)APHA. 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st Edition, Section 9221. American Public Health Association, Washington, D.C. (二)Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological Cultur

15、e Media. 2003. BD Diagnostic Systems.   注1：水样如须稀释，建议于稀释后30分钟内完成检测步骤，以免造成细菌死亡或增生，影响实验结果。图一水样稀释步骤表一三连续稀释度（10 mL、1 mL、0.1 mL）五试管重复测试时，阳性结果组合之MPN指数及95%信赖区间阳性反应组合 MPN/100 mL 95%信赖区间 阳性反应组合 MPN/100 mL 95%信赖区间 下限 上限 下限 上限 0-0-0 <1.8 6.8 4-0-3 25 9.8 70 0-0-1 1.8 0.090 6.8 4-1-0 17 6.0 40 0-1-0 1.8

16、0.090 6.9 4-1-1 21 6.8 42 0-1-1 3.6 0.70 10 4-1-2 26 9.8 70 0-2-0 3.7 0.70 10 4-1-3 31 10 70 0-2-1 5.5 1.8 15 4-2-0 22 6.8 50 0-3-0 5.6 1.8 15 4-2-1 26 9.8 70 1-0-0 2.0 0.10 10 4-2-2 32 10 70 1-0-1 4.0 0.70 10 4-2-3 38 14 100 1-0-2 6.0 1.8 15 4-3-0 27 9.9 70 1-1-0 4.0 0.71 12 4-3-1 33 10 70 1-1-1 6.

17、1 1.8 15 4-3-2 39 14 100 1-1-2 8.1 3.4 22 4-4-0 34 14 100 1-2-0 6.1 1.8 15 4-4-1 40 14 100 1-2-1 8.2 3.4 22 4-4-2 47 15 120 1-3-0 8.3 3.4 22 4-5-0 41 14 100 1-3-1 10 3.5 22 4-5-1 48 15 120 1-4-0 10 3.5 22 5-0-0 23 6.8 70 2-0-0 4.5 0.79 15 5-0-1 31 10 70 2-0-1 6.8 1.8 15 5-0-2 43 14 100 2-0-2 9.1 3.4

18、 22 5-0-3 58 22 150 2-1-0 6.8 1.8 17 5-1-0 33 10 100 2-1-1 9.2 3.4 22 5-1-1 46 14 120 2-1-2 12 4.1 26 5-1-2 63 22 150 2-2-0 9.3 3.4 22 5-1-3 84 34 220 2-2-1 12 4.1 26 5-2-0 49 15 150 2-2-2 14 5.9 36 5-2-1 70 22 170 2-3-0 12 4.1 26 5-2-2 94 34 230 2-3-1 14 5.9 36 5-2-3 120 36 250 2-4-0 15 5.9 36 5-2-4 150 58 400 3-0-0 7.8 2.1 22 5-3-0 79 22 220 3-0-1 11 3.5 23 5-3-1 110 34 250 3-0-2 13 5.6 35 5-3-2 140 52 400 3-1-0 11 3.5 26 5-3-3 170 70 400 3-1-1 14 5.6 36 5-3-4 210 70 400 3-1-2 17 6.0 36 5-4-0 130 36 400 3-2-