大蒜多糖B对小鼠免疫性肝损伤的干预作用

1、大蒜多糖B对小鼠免疫性肝损伤的干预作用         11-04-26 11:45:00     编辑：studa20                作者：孔祥槐， 郑敏， 张明霞， 王雪静 【摘要】  目的观察大蒜多糖B对小鼠免疫性肝损伤的影响。方法采用尾静脉注射卡介苗（BCG）加脂多糖（LPS）诱发小鼠

2、免疫性肝损伤。生化方法测定血清及肝组织ALT、AST及血清NO。显微镜观察肝组织病理结构变化。计算各组动物脾脏及胸腺质量体质量比值。结果模型组脾质量体质量比值、血清ALT、AST及NO活性显著升高（P<0.01），肝组织ALT及AST活性显著下降，肝细胞广泛水肿，呈气球样变，血管周围有炎性细胞浸润。 大蒜多糖B（600mg/kg.d, ig×12）治疗能使BCG+LPS免疫性肝损伤小鼠脾质量体质量比值下降（P<0.01），血清ALT、NO、AST活性较模型组显著降低（P<0.01）但仍高于正常对照组（P<0.01）; 肝组织ALT、AST较模型组显著增高（P&

3、lt;0.01） 但低于正常对照组（P<0.01）；肝细胞有轻度水肿及疏松化，肝窦变窄，但病变程度较模型组明显减轻。结论大蒜多糖B可抑制机体免疫活性对小鼠免疫性肝损伤具有一定的保护作用。 【关键词】  免疫; 肝损伤； 大蒜多糖B研究表明，病毒性肝炎的形成与机体的免疫应答密切相关1，卡介苗+脂多糖(BCG+LPS)诱导的免疫性肝损伤为病毒性肝炎发病机制及药物防治研究的有效实验模型24。从传统中药和食物中寻找有效的护肝成分已成为病毒性肝炎防治研究的趋势。大蒜药食同源，我们从大蒜球根中提取分离出新的安全低毒有效成分大蒜多糖A、B、C，并证实三者对四氯化碳所致小鼠化学性肝损伤具有保护

4、作用5；除A外，B及C在体外还有抗乙型肝炎病毒作用6；大蒜多糖C对BCG+ LPS诱导的免疫性肝损伤小鼠肝功能具有保护性作用3并与其抑制过度激活的体液免疫及细胞免疫功能有关7，大蒜多糖B则尚未进行研究。为此，本研究则进一步观察大蒜多糖B对小鼠BCG+LPS免疫性肝损伤小鼠有无保护作用，为其作为有效的抗病毒性肝炎药物提供实验及理论依据。1  材料1.1  动物健康雄性昆明小鼠，体质量2225 g，由湖北省医学科学院提供，饲养适应1周后开始实验。1.2  药品、试剂及仪器大蒜多糖B按照文献5方法提取。冻干卡介苗制（BCG）：兰州生物制品研究所，批号为20020501，

5、以灭菌生理盐水配制成10g/L的溶液备用。脂多糖（LPS）：SIGMA 公司。AST试剂盒：美国RANDOX公司产品，批号为3611H。ALT试剂盒：浙江东欧生物工程有限公司产品，批号为200206066 。NO试剂盒及蛋白定量试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。其余试剂为国产分析纯。主要仪器：日本东芝TBA-40FR 全自动生化分析仪，HIACHI U-2010紫外分光光度计，医学图像分析系统（BI2000型, 成都泰盟科技有限公司），Olympus BX40 系统生物显微镜。2  方法2.1  动物模型、分组、标本采集及制备小鼠免疫性肝损伤模型采用卡介苗（BCG）加脂多

6、糖（LPS）诱发即小鼠先尾静脉注射1% BCG活菌2 mg/只致敏，12 d后再尾静脉注射微量LPS（4 g/只）诱导肝损伤。小鼠随机分为正常对照组、免疫性肝损伤模型组、大蒜多糖B组600 mg/（kg·d），ig×12，每组20只。实验第1天，模型组及大蒜多糖B治疗组每只小鼠尾静脉注射1% BCG溶液2 mg即0.2 ml，正常对照组尾静脉注射灭菌生理盐水(0.2 ml/只)。次日起，正常对照组和模型组ig生理盐水qd×12；大蒜多糖B组 ig 600 mg/kg,  qd×12。实验第12天，模型组、大蒜多糖B组每只小鼠尾静脉注射LPS 4

7、 g，正常对照组给予等容积无菌生理盐水。12 h后，小鼠称重后摘眼球取血，收集血清备用；同时立即剖腹取同一叶肝组织，以冰生理盐水洗净，切取部分放入4%多聚甲醛中固定，部分置于-86冰箱中冻存备测；取胸腺及脾脏称重，计算胸腺及脾脏质量体质量比。2.2  指标测定及观察蛋白定量采用考马斯亮蓝法，小鼠血清及肝组织ALT和AST活性采用速率法以全自动生化分析仪测定，具体操作按说明书步骤进行。NO含量测定采用酶法,按试剂盒说明书进行。肝组织固定标本按常规方法制作石蜡切片及HE染色，光镜观察组织结构变化并显微拍照。2.3  统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计分析。 所有数据以

8、 ±s表示.多组间均数比较采用one-way analysis of variance (ANOVA)及Fisher LSD test(Least-significant difference)分析, P0.05 具有统计学差异。3  结果3.1  大蒜多糖B对免疫性肝损伤小鼠脾及胸腺质量体质量比的影响由表1可知，免疫性肝损伤模型组脾质量体质量比值显著增加（P<0.01），而大蒜多糖B治疗组脾质量体质量比值较模型组显著下降（P<0.01）但仍高于正常对照组（P<0.01）。各组胸腺质量体质量比值无统计学差异。3.2  大蒜多糖B对免疫性

9、肝损伤小鼠血清及肝组织ALT、AST，血清NO活性影响与正常对照组比较，BCG+LPS模型组血清ALT、AST、NO活性显著升高（P< 0.01），肝组织ALT、AST活性显著降低（P<0.01）。大蒜多糖B治疗组血清ALT、NO、AST活性较模型组显著降低（P<0.01），但仍高于正常对照组（P<0.01）; 肝组织ALT、AST较模型组显著增高（P<0.01） ，但低于正常对照组（P<0.01）。 结果见表1。表1  大蒜多糖B对免疫性肝损伤小鼠脾及胸腺质量体质量比、血清及肝组织ALT、AST、血清NO活性的影响(略)3.3  肝组织

10、结构变化光镜下可见正常对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝索呈放射状排列(图1a)；免疫性肝损伤模型组小鼠肝细胞广泛水肿，呈气球样变(图1b)，血管周围有炎性细胞浸润（图1a）；大蒜多糖B治疗组肝细胞有轻度水肿及疏松化，肝窦变窄，但病变程度较模型组明显减轻见图1c。     11-04-26 11:45:00     编辑：studa204  讨论    病毒性肝炎严重威胁着人类健康及生存质量，目前仍然缺乏安全、低毒、有效的特异性的抗肝炎病毒药物而以护肝治疗为主。从传统的中药或食物中

11、寻找有效部位或有效成分已成为病毒性肝炎药物防治研究趋势；而多糖成分作为一种重要的药物来源颇受关注。我们前期实验研究发现大蒜多糖B安全低毒并在体外具有较好的抗乙肝病毒活性，对四氯化碳所致肝损伤具有较好的保护作用5，6；基于四氯化碳化学性肝损伤模型与人类病毒性肝炎发病机制上差异较大，而BCG联合LPS诱导的小鼠免疫性肝损伤模型类似于人病毒性肝炎的急性或亚急性损伤过程24，且应用此模型我们还发现大蒜多糖的另一有效成分C 通过抑制过度激活的免疫机能而对免疫性肝损伤小鼠肝功能有较好的保护作用3，7，因而，我们进一步采用此免疫性肝损伤模型来评价大蒜多糖B对于病毒性肝炎防治的应用价值。  

12、;  实验中大蒜多糖B的使用剂量根据前期毒性实验、体外抗肝炎病毒活性实验及四氯化碳肝损伤护肝实验采用剂量确定为600 mg/kg·d 。脾为机体重要的免疫器官，其结构及功能与机体状态紧密相关，本研究发现，BCG+LPS免疫性肝损伤小鼠脾质量体质量比值显著增大，显示此模型中脾组织增生反应明显，免疫应答活跃；而给予大蒜多糖B（600 mg/kg·d, ig×12）治疗后升高的脾质量体质量比值有所下降，但仍高于正常组水平，提示大蒜多糖B可有效抑制BCG+LPS诱发机体免疫应答的活化及增强，但尚不能完全对抗。血清ALT、AST活性升高及肝组织ALT、AST活性下

13、降为肝功能受损的特异性指标3；研究结果显示，大蒜多糖B（600 mg/kg·d, ig×12）治疗可有效降低免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性并升高肝组织ALT、AST水平；同时降低血清NO水平，减轻肝细胞水肿及变性程度；表明大蒜多糖B 对BCG+LPS引起的肝功能受损具有较好的保护作用。结合前期的研究结果，我们初步认为，大蒜多糖B作为一种较为理想的护肝药物具有以下特点： 安全、有效、低毒； 来源广，提取工艺相对简单； 既具有较好的抗病毒作用又对肝结构及功能有较好的保护作用； 其护肝作用可能与其抑制免疫机能降低血清NO活性有关；至于大蒜多糖B开发应用于病毒性肝炎防治还需

14、进一步深入和完善各项研究。【参考文献】  1邱英锋，缪晓辉，王俊学，等.卡介苗加脂多糖建立大鼠急性免疫性肝损伤模型的研究J.实验动物与科学管理,2004，21(3):15.2Ding AH, Nathan CF. Trance level of bacterial lipopolysaccharide prevents interferon- or tumor necrosis factor-alpha from enhancing mouse peritoneal macrophage respiration burst capacityJ. Immunol,1987, 139:1971.3赵 骥，郑 敏，鲍翠玉，等. 大蒜多糖C对免疫性肝损伤小鼠血清及肝组织ALT、AST的影响J.咸宁学院学报（医学版）,2005，19(1):24.4Ferluga J, Kaplun A, Allison AC. Protection of mice against endotoxine induced liver damage by anti-inflammatory drugJ. Aaents Act