大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA与marA基因分析

1、2*大肠杆菌耐药株的体外诱导及其 acrA和marA基因分析张海旺1邓旭明2*张煜1苏杰1胡仲明3(1.河北北方学院，河北 张家口，075131 ；长春；130062)2.中国人民解放军军需大学，吉林长春；130062； 3.军事兽医研究所，吉林acrA 禾n marA 基ATCC25922进行体外摘要：目的检测大肠杆菌在某些抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与因突变的关系。方法分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株诱导培养，测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化；对各菌株的 acrA和marA基因进行克隆和测序。结果 四环素诱导株产生多重耐药，氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药；四环素

2、诱导 株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与 ATCC25922的一致。结论四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突变，诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致。关键词：大肠杆菌多重耐药外输泵acrA marA由于抗菌药物的广泛、持续和不当使用，各种病原菌对抗菌药物的耐药性日趋严重。现已发 现细菌细胞膜上的外输泵(efflux pump )的表达水平提高，能主动将扩散入细菌细胞内的药物或 其他底物泵出菌体外，从而使细菌获得非特异性的耐药性。大肠杆菌是畜禽的重要致病菌，是发 现外输泵

3、最多的细菌，现已发现了约30种外输泵。一般认为 AcrAB -TolC是大肠杆菌主要的外输泵。它包括药物质子转运子AcrB、周质融合蛋白 AcrA和外膜通道蛋白 TolC2。 MarA是-个正调控蛋白，可增强acrAB和tolC的表达。本实验用四环素、氯霉素和环丙沙星通过人工体外诱导大肠杆菌使之产生耐药性，对AcrA和MarA的基因acrA和marA进行测序分析，检测耐药性产生与acrA和marA突变的关系。1材料和方法1.1材料菌株：大肠杆菌质控株 ATCC25922，购自吉林省卫生监督检测中心。抗菌药：头孢噻肟、青霉素钾等，均为标准品或对照品，中国药品生物制品检定所出品；盐 酸环丙沙星，对

4、照品，中国兽医药品监察所出品。染色试剂：结晶紫酒精饱和溶液、草酸铵溶液、革兰氏碘溶液、石碳酸复红溶液等按药品 微生物学检验手册3进行配制。载体与质粒：克隆载体为PGEMT, Promega公司产品。dNTP酶与试剂：T4 DNA连接酶、Ex TaqTM DNA聚合酶、各种限制性内切酶、溶菌酶、蛋白酶 均为TaKaRa公司产品。(Amp、CaCb、其他试剂：乙二胺四乙酸二钠(EDTANa)、焦碳酸二乙酯(DEPC, Sigma公司产品；)，TaKaRa公司产5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X- gal )、异丙基-B 硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素 琼脂糖、羟基甲基氨基甲烷(Tris )

5、等均为TaKaRa公司产品；饱和酚、氯仿、异丙醇、 葡萄糖、甲基红等，均为国产分析纯试剂；DNA片 段凝胶回收试剂盒( Agarose Gel DNA P urification Kit Ver.2.0 品；国家自然基金资助项目，No 30270999作者介绍：张海旺，生于1956年，博士，教授。研究方向：耐药机理。*通讯作者 E-mail : zhw5148分子量标准参照物：DNA Marker DL2,000、入-Hi nd 川 digest DNA Marker ，均为 TaKaRa公司产品。引物：根据GenBank中acrA、marA基因序列设计 PCR扩增引物：acrA的上游引物（P

6、ACRF） 序列为 5 - ATG AAC AAA AAC AGA GGG TTT ACG CCT 下游弓 1物（PACR R） 5 - TTA AGA CTT GGA CTG TTC AGG CTG3', marA的上游引物（PMARF）序列为 5'-ATG ACG ATG TCC AGA CGC AAT AC -3 下游引物（PM AR R） 5'-CTA GCT GTT GTA ATG ATT TAA TGG3'。上海博亚生物技术有限公 司合成。仪器：生物显微镜， OLYMPUS 产品； PCR 扩增仪， TC-25/H 型，杭州 DAHE THERMO

7、- MAGNETICS CO.LTD 产品；电泳仪， DYY -6B 型，北京市六一仪器厂产品；空气浴振荡器， HZQ -C,哈尔滨市东明医疗仪器厂生产；高速台式冷冻离心机，TGL - 16M，长沙湘仪离心机仪器有限公司生产等。1.2. 方法1.2.1 菌株鉴定 对购进的菌株作生化和形态鉴定,以确保菌株的可靠性：用营养肉汤作复苏培养,再将菌液 接种于琼脂平板 37oC 培养至长出菌落；取上一步得到的单菌落进行糖发酵试验（葡萄糖、乳糖、 麦芽糖、甘露醇、蔗糖） 、靛基质试验、 M.R 试验、 VP 试验鉴定及革兰氏染色的光镜观察。鉴 定确认为 ATCC25922 的菌株作后续实验之用。1.2.2

8、 MIC 测定按照 NCCLS （National Committee for Clinical Laboratory Standards ）规定的方法配制包括诱导 剂（氯霉素、四环素、环丙沙星）在内的各种受试抗菌药的标准溶液；用2倍连续稀释法配制各种含抗菌药的营养肉汤培养基，抗菌药的首选浓度范围为0.1254.0卩g/ml培养基（据细菌生长情况再作升或降的调整）。在1ml培养基中接种100卩I菌液（约为105CFU）; 37oC培养24h,确 定 MIC 。诱导剂的麦康凯培养基接种适量培养物（约1O5CFU ）,37oC培养24h,1X MIC诱导剂的培养基 37oC培养24h，以此类推，逐

9、渐提高培养MIC的128倍（据细菌生长情况诱导剂浓度提高幅度可在12倍1.2.3 诱导分别在三种含1/2 X MIC 挑选生长良好的菌落,接种于 基中诱导剂的浓度直到诱导前 于原浓度的范围适当调整,也可当细菌生长不良时在同一个浓度重复传代培养）1.2.4 耐药谱的确定上一步最后获得的诱导剂浓度达到 128XMIC 的耐药株,作 4次无诱导剂传代培养后,再分 别测定三个诱导株对所有受试抗菌药的 MIC ,以确定三个诱导株的多重耐药谱。1.2.5 受试菌株 acrA、 marA 基因序列的检测 据上一步耐药谱检测结果,氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的耐药谱相近,而四环素诱导株的耐药谱与之差异较大，故

10、选择四环素诱导株（名为 SEMR ）、环丙沙星诱导株（名为 seici ）和 质控株（ATCC25922 ）作acrA、marA基因序列的检测。1.2.5.1目的基因（acrA、marA）的获取1.2.5.1.1 DNA 提取：按卢圣栋等 4的方法提取 SEMR、 SEICI 和 ATCC25922 的基因组 DNA。1.2.5.1.2 acrA、marA基因的PCR扩增：以大肠杆菌染色体 DNA为模板，用引物PACR-F和PACR -R 扩增 acrA （全长 1194bp）,用 PMAR - F 和 PMAR - R 扩增 marA （全长 390bp）。取 5 MPCR 产 物在 0.7

11、%琼脂糖凝胶进行电泳观察 PCR 结果。1.2.5.1.3 PCR产物的回收：用 DNA片段凝胶回收试剂盒回收acrA和marA基因的PCR产物，方法按试剂盒使说明书进行。1.2.5.2 acrA 、marA 基因的克隆将回收的 PCR 产物连接到 pGEM T 载体上。反应体系为：k), 3 jJ; pGEM T vector (50ng/ U), 1 M; T4 DNA1.2.5.2.1 目的基因片段与载体的连接：感受态细胞 5。5进行。CaCl2法制备DH5 a参照分子克隆指南利用 a互补法（蓝/白菌落筛选法）进行阳性克隆的初步筛选2X Rapid Ligation Buffer , 5

12、 J; PCR 产物（2ng/ Ligase, 1 J。 16 C连接过夜。1.2.5.2.2 感受态菌的制备：5。1.2.5.2.3 重组质粒的转化：1.2.5.2.4 阳性克隆的筛选：1.2.5.3 重组质粒的鉴定1.2.5.3.1 提取质粒：碱裂解法 5 提取质粒,作 0.7琼脂糖凝胶电泳,紫外分析仪观察并拍照。1.2.5.3.2重组质粒的酶切鉴定：用Ncol和Not I双酶切鉴定 acrA - pGEM -T和marA - pGEM - T质粒。将经过电泳筛选出的疑似阳性克隆质粒进行Neo I和Not I双酶切反应，同时做阴性克隆质粒的酶切对照。酶切反应体系为：克隆质粒，5J; 10X

13、 H Buffer , 1J ; 0.1%BSA , 2 J; NeoI, 1J； Not I 1J ; ddH2O, 10 J。37 C恒温水浴 24h。0.7%琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪下 观察电泳结果并拍照。1.2.5.3.3 重组质粒的 PCR 扩增鉴定：利用 PCR 反应,对经过上述鉴定的疑似阳性质粒再作 PCR 扩增鉴定。用引物 PACR F和PACR R扩增鉴定 acrA pGEM T质粒；用 PMAR F和PMAR R 扩增鉴定 marApGEM T 质粒。取 5Jl PCR 扩增产物在 0.7%琼脂糖凝胶进行电泳,在紫外灯 下观察电泳结果并进行拍照。1.2.5.4 重组质粒的

14、核苷酸序列测定与分析 对经上述鉴定后均符合要求的阳性克隆质粒进行序列测定（上海博亚生物技术有限公司完成）,用 DNAsis 软件分析测序结果。2 结果MIC 见2.1 受试药物的 MIC 包括三种诱导剂（氯霉素、四环素、环丙沙星）在内的各种受试抗菌药对于质控株的表1。变化详见表 2。从表中可见， 在四环素诱导株， 没有明显的提高外，青霉素钾、头孢噻肟、四 氧氟沙星、诺氟沙星和头孢西丁的 MICMICMIC2.2 诱导株的耐药性变化四环素、 环丙沙星和氯霉素三个诱导株的 除小诺霉素、妥布霉素、阿米卡星和链霉素的 环素、土霉素、氯霉素、利福平、甲砜霉素、环丙沙星、 提高幅度都有达到或超过 4倍（经

15、统计处理，MIC变化值4X MIC为具有显著性意义）；在环丙 沙星诱导株,只有头孢噻肟 MIC 提高倍数达到或超过了 4,而其它受试抗菌药的 MIC 变化都没 有显著性意义； 氯霉素诱导株与环丙沙星诱导株相似, 只有头孢噻肟的 MIC 提高具有显著性意义, 而其他药物没有显著意义。2.3 acrA、 marA 基因检测结果2.3.1 SEMR、SEICI 和 ATCC25922 基因组 DNA 的提取结果从 ATCC25922、SEMR、SEICI 中提取的染色体 DNA 作 0.7%的琼脂糖凝胶电泳,观察到一 条特异带，大于23kb。见图1。2.3.2 SEMR、SEICI、ATCC2592

16、2 acrA、marA 基因的 PCR 扩增结果acrA、marA的PCR扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，以 DNA Marker DL2,000 为对照，结 果在约1194bp和390bp处分别出现特异的目的片段，与预计的片段大小吻合。见图2、图3。2.3.1阳性克隆的筛选结果 转化平板经过落为阴性克隆，为2.3.2克隆质粒的表1受试药物的MIC(ug/ml)Table 1 MIC of antibacterial agents (ug/ml)抗菌药antibacterial agentsMIC抗菌药antibacterial agentsMIC抗菌药antibacterial agent

17、sMIC青霉素钾Benzy lp enicillin K64氧氟沙星 Ofloxacin0.5甲砜霉素Clinfenicol16头抱噻肟 Antibacterial0.25诺氟沙星 Norfloxacin0.25阿米卡星 Amikacin32四环素 Tetracycline4头抱西丁 Cefoxitin0.5环丙沙星 Cip rofloxacin0.25土霉素 Oxytetracycline8链霉素 Streptomycin64妥布霉素 Tobramycin8氯霉素 Chloramphenicol16小诺霉素 Micronomicin1利福平 Rifampicin32表2诱导菌株的MIC变化T

18、able2 Change for MIC of induced strains受试药物antibacterial agents诱导后MIC提高倍数Increasing po wer of MIC after induction四环素诱导株 strains of Tetracy(环丙沙星诱导株Jinestrains of Cip rofloxacin氯霉素诱导株trains of Chlora mp henicol青霉素钾 Benzylpenicillin K802头抱噻肟 Antibacterial25688四环素 Tetracycline12820土霉素 Oxytetracycline162

19、0氯霉素 Chloramphenicol420利副平 Rifampicin400甲砜霉素Clinfenicol1600环丙沙星 Ciprofloxacin400氧氟沙星Ofloxacin822诺氟沙星Norfloxacin822头抱西丁 Cefoxitin410链霉素 Streptomycin100小诺霉素Micronomicin122妥布霉素Tobramycin000阿米卡星Amikacin0011620h 37C的倒置培养，出现了稀疏的蓝色和白色的克隆菌落。其中蓝色菌T载体自身环化所产生。白色的菌落为疑似阳性克隆，需做进一步的鉴定。结果可见到特异目的带，见图PCR鉴定分别利用扩增引物，PC

20、R鉴定各克隆质粒，acrA - PGEM -T 和 marA -pGEM - T 进行 Neo I 和2974bp、1220bp和416bp处分别出现特异的载体、2.3.3克隆质粒的酶切鉴定将经过PCR鉴定筛选出的疑似阳性克隆质粒 Not I双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果在约 acrA和marA的目的片段。见图 5、图6。2.3.4 acrA、marA基因序列的测序结果由DNAsis软件分析测序结果表明，acrA和marA克隆质粒序列，在 ATCC25922、SEMR和SEICI都一致，与 GenBank中发表序列同源性为 100%, acrA和marA基因在四环素诱导株和环 丙沙星诱导

21、株均没有发生突变。3讨论普遍的观点认为，抗菌药物的使用是病原菌产生耐药性的关键所在。由于抗菌药物的广泛、 持续和不当使用，给细菌的生存环境造成了选择性压力，这种环境压力因素可以通过多种机制导 致病原菌对抗菌药物产生耐药性。药物外输泵是一类位于细胞膜上的具有特殊结构的膜转运蛋白 质，其作用机理为当细胞内的药物浓度聚集达到一定数值时， 药物外输泵系统相关 mRNA 的表达 增加，结果使细胞膜上外输泵的数量增加，使细胞内的药物被泵出，从而使细菌耐药。由于外输 泵种类较多，作用底物广泛(包括抗菌药、染料、消毒剂、洗涤剂、有机溶剂、亲脂阳离子、脂类、抗微生物多肽类、化学药物等)，所以主动外输系统介导的耐

22、药性呈现多重耐药的特点®9。本实验依据细菌耐药性的原因和机理，人为造成一种抗菌药的选择性压力环境，对大肠杆菌质控 株进行体外选择性诱导培养， 以期产生耐药性。 从诱导前后多种抗菌药 MIC 的变化结果看， 四环 素诱导株，除小诺霉素、妥布霉素、阿米卡星和链霉素的MIC 没有明显的提高外，青霉素钾等11 种抗菌药的 MIC 都有明显提高，即表现了不同程度的耐药。从耐药谱看，产生耐药的抗菌药 分属于几类在结构和作用机理上各不相同的类别，说明四环素诱导株产生了多重耐药。大肠杆菌是发现外输泵最多的一种细菌，在埃希氏大肠杆菌上发现了约30 种外输泵，但一般认为 AcrABTolC 是最主要的外

23、输泵 10 。有人报导大肠杆菌外输泵 AcrAB 的作用底物包括吖 啶橙、结晶紫、溴乙啶、镰孢菌酸、四环素、氯霉素、新霉素、红霉素、夫西地酸、SDS、萘啶酸、氨比西林、氟喹诺酮类、 3 -内酰胺类、禾U福平、吐温 X-100等多种制剂9、11。本实验的耐 药谱在受试的抗菌药范围内耐药谱与 AcrAB 的作用底物大体一致。这个结果提示，四环素诱导 大肠杆菌株多重耐药性的产生可能是由于激活了它的包括 AcrAB 在内的主动外排系统。本实验中另外的氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株只对头孢噻肟一种抗菌药产生了耐药。导致这种结果的原因我们还不能确切定论， 参考有关资料推测， 假定 AcrAB 激活是多重耐药

24、产生的直 接机制，则 acrAB 又受到 mar 等的调控，有实验表明环丙沙星不是操纵子 mar 的诱导因子，但是 操纵子 Mar 的诱导能力对药物产生低水平的耐药性； Hachler 认为，大肠杆菌操纵子突变体能被 选择，选择时用环丙沙星选择的频率大大低于能被接受的诱导物如四环素等的频率12。由此可以认为抗菌药的选择性压力与主动外输系统的交互作用在一定程度活范围内是有特异性的。四环素能较容易地诱导大肠杆菌产生多重耐药这一结果还提示，四环素类抗菌药的使用要慎重或不提倡使用，特别是对于肠杆菌疾病的治疗。由此还可以联想到，在目前人们对付病原菌耐 药性尚没有确实有效的办法的情况下， 倒可以如世界卫生

25、大会 (World Health Assembly, WHA ) 13 敦促的那样，在消除对病原菌人为的选择性环境压力，减少对耐药性的诱导方面多下些功夫。这 不仅在现在， 即使在将来人们逐渐找到了一些对付病原菌耐药性的办法，仍然不失为具有战略意义的对策。从实验结果还发现，产生了耐药的抗菌药其 MIC 的提高幅度不尽一致。对此种现象产生的 原因，推测是由于不止一种外输泵的激活，或是可能还有其他的耐药机制的作用。因为细菌的耐 药有着多种而复杂的机制 14，一种或几种机制可能同时作用于某一种/一类抗菌药，多种耐药机制错综的作用于不同的各类药物， 可能是导致本实验中这种耐药的不整齐性的主要原因。特别是

26、四环素的 MIC 提高幅度达 128 倍，极有可能存在另外的四环素耐药机制，比如四环素排出系统(Tet)的参与。本实验对多重耐药株、单药耐药株和质控株对编码 AcrAB -TolC 外输泵组分之一 AcrA 2的 acrA基因和其调控基因 marA15作了完整的克隆和侧序，二者的测序结果在上述的3个菌株都是一致的，与文献报道结果的同源性均为100%，说明SEMR和SEICI的acrA和marA基因都没有碱基的改变，四环素、环丙沙星的诱导培养引起菌株的药敏变化是在acrA和marA基因没有突变的情况下发生的，即 SEMR 菌株多重耐药性的产生是由于除 acrA 和 marA 突变以外的其他原因。

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