人类重要传染病病原体耐药机制基础探究

1、项目名称:人类重要传染病病原体耐药机制的基础首席科学家:王明贵复旦大学起止年限:依托部门:、研究内容拟解决的科学问题：鉴于我国在重大传染病的分子传播规律、耐药产生机制研究上的滞后，本课题所要解决的关键科学问题是： 建立系统的耐药病原体分子监测网络与完整的 反映中国耐药情况的耐药基因谱， 系统地了解新耐药基因或耐药位点的产生与演 变规律，明确主要耐药机制，获得治疗重要传染病耐药的新途径。1. 建立系统的耐药病原体分子监测网络与完整的反映中国耐药情况的耐药 基因谱：分子流行病学作为一种新的研究方法研究传染病病原体的传播规律， 在 西方发达国家已经广泛应用， 并已经取得很好的成果。 但是病原体流行病

2、学的传 播规律因地而异， 国外的研究成果不能完全适用于我国， 解释我国的传染病病原 体及其耐药性的流行情况， 更不可能用于指导我国传染病及其病原体耐药性的防 治工作。因此， 建立我国耐药菌的分子耐药监测平台， 应利用现代分子流行病学 的手段， 研究我国耐药病原体的产生机制与传播规律， 在此基础上建立耐药传播 的预警机制与控制策略。2. 系统地了解新耐药基因或耐药位点的产生与演变规律，明确主要耐药机 制：细菌方面，着重研究近年来新出现的严重的铜绿假单胞菌对碳青霉烯类 耐药的形成机制，近年来新发现的大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药的质粒介导耐药 机制、 ESBL 编码基因的来源及传播机制，这些内容在国际

3、上均尚未进行深入研 究。我国耐药结核分枝杆菌新耐药基因变异位点研究，对新耐药机制进行深入 的研究，指导我国耐药结核分枝杆菌感染的诊断与防治。 在上述分子流行病学及 耐药机制研究的基础上， 应用分子生物学信息技术， 直接从临床标本中检测细菌及结核分枝杆菌， 同时检测其耐药性。 大大缩短病原体及其耐药性的病原诊断时 间，指导临床及时、有效地选用药物。HBV耐药机制的研究包括HBV对核苷 类耐药规律、宿主因素对治疗效果的影响及 HBV 新突变株生物学特性的研究， 建立可靠的HBV体外监测系统。HIV耐药基因突变与耐药特性间的定性和定 量关系，耐药的生物学特性， 为建立使用高灵敏度、 高通量的基因型测

4、定准确预 测耐药特性提供依据，同时对抗 HIV 靶位 HIV 逆转录酶结构和功能的进行研 究。3. 获得治疗重要传染病耐药的新途径 ：耐药病原体感染的治疗措施有限、病 死率高，通过耐药真菌新药靶的筛选及新型药物的筛选、 抗菌药物防突变浓度研 究、抗病毒药联合抗 HBV 等研究，探寻对付耐药病原体的新途径。 开展耐药 HIV 病毒与相关细胞因子并重的结构生物学研究， 以侧重病毒分子变异能力以外的机 制包括细胞靶位的新路线解决 HIV 耐药的新途径。本研究的最终目标为阻止或延缓传染病病原体耐药性的产生及传播， 有效治 疗耐药病原体的感染， 提高传染病的治愈率， 增进人类健康水平。 这也是本研究 要

5、解决的最根本问题。主要研究内容 ：本研究项目包括重要传染病的 5种主要病原体： 细菌、结核分枝杆菌、 人类 免疫缺陷病毒、 乙型肝炎病毒及白色念珠菌。 各病原体的研究内容包括耐药性的 分子流行病学、耐药性的形成及传播机制（包括新耐药基因的研究） 、耐药菌的 快速诊断、耐药菌感染的预防与治疗新途径等方面。1细菌耐药机制及耐药性防治1）多重耐药铜绿假单胞菌的耐药机制通过对碳青霉烯酶、膜通透性改变及主动外排机制 3 方面的较全面的研究， 明确多重耐药铜绿假单胞菌的耐药机制。 国内近年研究发现在铜绿假单胞菌中存 在一种能水解亚胺培南但活性又能被氯唑西林抑制的酶（类似于 AmpC 酶但水 解底物轮廓扩大

6、包括了碳青霉烯类抗生素） ，因此极可能存在新的碳青霉烯酶及 其它耐药机制同时参与，计划对具新特性的p内酰胺酶进行进一步的研究，预期 会有新的发现。2）大肠埃希菌耐药机制研究1）大肠埃希菌对喹诺酮类的质粒介导耐药机制研究：计划对大肠埃希菌对 喹诺酮类的质粒介导耐药机制进行深入研究， 研究内容包括： 质粒介导耐药基 因 qnrA 及 qnrB 分子流行情况，明确质粒介导耐药机制在喹诺酮类耐药性形成中 的作用。耐药机制研究：qnr产物Qnr蛋白对喹诺酮作用靶位的保护作用、Qnr 作用位点和 Qnr 蛋白的模建及晶体结构的研究，明确耐药的形成机制。2）大肠埃希菌等革兰阴性杆菌 CTXM 型 ESBLs

7、 的传播机制及传播规律： 计划在原有基础上作进一步深入的研究，研究 CTXM 编码基因的起源及其传 播规律，从而有利于耐药菌的控制。3）建立耐药菌快速基因诊断方法采用分子生物信息学技术， 研究病原菌的基因组序列或特征性基因序列和耐 药基因序列，目标是建立多重 DNA 引物的反应模式，在鉴别革兰阳性和革兰阴 性菌的主要菌种的同时， 测定耐药谱。 采用分子生物学方法直接从人体体液或相 关标本中检测细菌的特异性 DNA ，从而建立快速、准确的病原菌诊断方法。4）建立常用抗菌药治疗各种重要病原菌的“防突变浓度”范围通过建立体外模型测定常用各类抗菌药对重 要病原菌的防突变浓度 （mutant-preve

8、ntion concetration, MPC）和“突变选择窗：即建立不同抗菌药对 不同细菌的防突变浓度范围及“突变选择窗”， 据此制订或调整抗菌治疗方案，达 到提高治愈率，减少耐药菌产生的目的。2. 耐药结核分枝杆菌的分子流行病学及耐药机制1）建立先进的分子流行病学方法着重于阐明一线抗结核药物和主要二线抗结核药物的耐药株基因突变频率 及中国流行耐药株突变特点、 国内主要结核杆菌耐药株的优势菌群， 耐药结核菌 群的流行区域、流行趋势及范围，分析耐药菌群的种类、分布、分子流行病学特 征。同时，以某一研究地区（如上海）为研究场地建立示范性分子流行病学预警 以及快速鉴定耐药传播 （内源性或外源性）

9、模式的平台， 选用有价值的分子流行 病学标记，如IS6110为基础的DNA指印技术、间区寡核苷酸分型（spoligtyping）、 分枝杆菌散在重复序列( mycobacterial interspersed repetitive uni，t MIRU ),富含GC的多态性（polymorphic GC-rich sequenee，PGRS）等项技术为基础进行聚 类分析，分析比较耐药簇菌株和非耐药簇菌株的差异， 确定近期外源性感染的作 用，揭示耐药结核病的传播规律如易发病的高危人群、 传播场所以及其它影响传 播的危险因子。2）描绘完整的我国结核病耐药基因谱，发现新的耐药机制在结核分子流行病学研

10、究基础上绘制能对我国临床诊断与防治提供指导意义 的耐药基因谱， 对相应的耐药机制作出研究。 对于未发现当前报道的耐药基因的 菌株，拟以基因芯片与蛋白质组学方法寻找差异基因与差异蛋白， 定位新的耐药 基因或发现新的耐药机制。（3）建立符合我国耐药现状与国情的快速分子药敏检测系统 结核耐药性的快速鉴定对结核病的早期诊断、 鉴别诊断、 个体化的有效化疗 和控制传播都有极其重要的意义。 我们将建立基于我国结核病耐药基因谱以及耐 药机制研究基础上的快速分子药敏检测系统， 并研究基因型耐药与表型耐药的相 关性，用前瞻性方法指导临床用药，评估基因型耐药快速检测的临床价值。3. HIV 耐药性分子流行病调查和

11、耐药机制研究1) HIV 耐药性的分子流行病学研究利用已有的全国 HIV 耐药性调查网络开展未接受 HIV 抗病毒治疗和治疗后 人群和治疗地区的耐药性流行病学调查， 耐药毒株出现的情况以及影响因素分析 在我国艾滋病高发区开展 HIV 耐药性的分子流行病学研究，对接受国家免费抗 病毒治疗人群通过套式PCR扩增HIV蛋白酶和逆转录酶基因并进行序列测定, 将测得序列进行分析与国际 HIV 耐药数据库进行比对和分析 ,得出治疗人群 HIVHIV 的基的耐药突变基本资料,包括其类型、人群分布和发生发展规律。确定 因亚型,并研究不同病毒亚型与耐药性的关系。2)HIV 耐药机制研究从测定到的含各类耐药突变

12、HIV 毒株的病人分离病毒,经体外药敏试验确 定 HIV 耐药突变株基因型与表型间的关系。同时对 HIV 野毒株加以不同浓度的 相关药物压力筛选出相应的耐药株,研究 HIV 与药物的相互作用,以探讨 HIV 耐药株的出现与药物浓度, 用药剂量与病毒复制抑制间的关系。 了解耐药毒株的 基因变异特点,确定我国 HIV 流行株的耐药株类型,基因型及表型的特点。研 究耐药病毒株的适应性, 结合其在体内存在情况, 探讨其在人群中传播的潜在危 险性。3) HIV 逆转录酶结构和功能的研究运用分子生物学和X-射线结晶学方法开展与艾滋病药物相关的HIV逆转录 酶结构和功能的研究, 在分子水平研究耐药性形成机制

13、, 研究包括病毒的和与之 复制和变异相关的细胞组分和分子间的相互作用及其影响因素。4）建立综合性 HIV 耐药数据库结合耐药分子流行病调查、体外耐药实验测试和 HIV 酶的结构生物学和其与细胞组分和分子的相互作用的研究结果，建立综合性 HIV 耐药数据库，采用多因素分析方法，确定我国不同 HIV 耐药基因型和表型间的关联特点，预测我国抗 HIV 治疗中的耐药出现频率和强度， 提出我国抗 HIV 治疗中减少HIV 耐药毒株出现的药物配伍、剂量调整和方案改进的科学建议，提出针对耐药HIV 毒株的新的抗 HIV 药物的新设计方案和新技术路线。4. 乙型肝炎病毒的耐药机制1）核苷类似物对 HBV 的耐

14、药规律及其天然无应答性的原因拟对国内 /国际临床验证和临床抗病毒治疗的病人系列标本，采用PCR 扩增产物直接测序和 /或克隆后测序的方法，以及高灵敏度单一基因分子点突变检测技术(detection of base substitution on a single molecu, DBSSM),对比治疗前和发生临床耐药时 DNA 序列结果，寻找与临床耐药有关的变异位点及其规律。对已确定的单一耐药位点变异， 课题组已建立聚合酶链反应限制性片段多态性分析法（PCR-RFLP）、实时荧光PCR法检测，分析其发生、发展、与临床耐药病情的关系。2） HBV 变异序列特异性细胞免疫反应的研究目前国内外对变异

15、耐药发生后为何出现不同临床结局缺乏系统的研究， 为何同为出现 YMDD 突变的患者 , 一些肝病变加重甚至肝功失代偿死亡，而另一些肝功能可完全正常？核苷类似物治疗发生 YMDD 突变且病情加重者是由于机体免疫应答的不同还是有更重要的 HBV 突变？初步研究显示 HBV 耐药突变后“表位漂移”及“免疫显性消长”可能是影响HBV耐药不同应答转归的重要机制。本课 题计划对此进行深入的研究。3）对导致干扰素抗病毒治疗失败的宿主因素进行分析干扰素用于慢乙肝抗病毒治疗也已近二十年时间，为什么在相同基因型、 重要位点变异情况相似的情况下，临床抗病毒疗效差异悬殊，抵抗干扰素治疗 的机制也待阐明，我们以往和国外

16、的一些研究工作曾就 HBV 基因型以及其他 位点的基因变异对干扰素抗病毒疗效的影响进行分析，虽发现一些可能相关的 原因，但结果尚不能令人满意。本课题将从宿主遗传因素的角度进一步探讨导 致 HBV 抵抗干扰素治疗的机制。4）建立并优化乙肝病毒表型耐药及药敏实验的体外鉴定系统国外已经开始利用体外药敏系统来协助临床医生选择抗病毒药物。如体外 实验发现阿德福韦对 YMDD 变异株有明显的抑制作用， 临床试验结果也证实了 这一结果，而对阿德福韦产生耐药的乙肝病毒 N236T 变异在体外试验中仍对拉 米夫定敏感，IC50的改变3.5倍。目前国内在基因耐药检测技术方面发展较快, 已建立基因芯片、 Real-

17、Time PCR、RFLP 等方法，但在病毒药敏检测系统方 面还未见报道，主要原因是该系统涉及技术较复杂。我们计划建立并优化乙肝 病毒表型耐药及药敏实验的体外鉴定系统，以用于研究重要的 HBV 耐药突变 株的生物学功能，如在中国发现的 rtG172E, rtG174C和rtG172E/rtG174C三种 新变异株，包括体外复制能力、交叉耐药性等。同时，体外药物敏感性检测系 统可以为临床医生合理处理耐药病毒感染提供强有力的依据。5白色念珠菌耐药机制研究1）白色念珠菌耐药性的分子流行病学研究建立真菌库， 测定各菌株对各类抗真菌药物的敏感性， 并重点研究氟康唑作 用靶酶基因CYP51和多药耐药蛋白基

18、因CDR1、MDR1，转录调控因子TAC1、CAP1 基因的表达差异；从中选择不同来源的白色念珠菌耐药株及其亲本菌，通 过基因测序，分析CYP51和TAC1、CAP1基因的序列变异特点，发现耐药优势 变异；比较我国与国外耐药变异的差异， 总结我国白色念珠菌耐药变异的特点及 分布规律，并分析我国特有的耐药变异类型及形成原因。2）白色念珠菌耐药相关新基因功能及耐药性形成机制研究研究耐药株及其亲本菌的基因组和蛋白质组表达改变特点， 发现新的耐药相 关基因；构建新发现的白色念珠菌耐药相关基因的缺失菌和高表达菌， 通过考察 药物敏感性、耐药性形成、生物膜形成、菌丝形成、药物外转运、靶酶活性、基 因表达调

19、控、 生长周期及其他相关基因表达等表型的差异， 明确新发现的耐药相 关基因在耐药性形成中的作用。分离、纯化蛋白，分析蛋白的功能。3）抗白色念珠菌耐药性新途径研究利用白色念珠菌耐药株， 筛选抗耐药白色念珠菌药物， 或与氟康唑联合筛选， 寻 找氟康唑增敏剂；利用高表达含关键变异位点的耐药基因 （CYP51、TAC1、CAP1） 的白色念珠菌，筛选抗耐药白色念珠菌药物或抗真菌药物增敏剂。二、预期目标总体目标：1. 对我国重要传染病病原体的分子流行病学情况及耐药性进化规律有一个 较全面的了解，从而有助于制订方案，防治耐药性的产生与传播。2. 明确重要病原体包括结核分枝杆菌、细菌、 HIV、 HBV 及

20、白色念珠菌对 主要抗感染药物的耐药机制、耐药规律，以及耐药性的形成及传播机制。3. 发现新的耐药基因或基因突变位点，提升我国的医学科研水平和在国际的影响力。4. 探索治疗耐药病原微生物的新途径如耐药真菌及 HIV 新药及 /或新药靶的 筛选等。5. 建立一支具我国特色的病原体耐药机制研究的科研队伍，培养一批中青 年科研骨干。五年预期目标1. 理论方面：1）通过重要传染病病原体的分子流行病学的研究，了解我国传染病病原体耐药性的形成及传播规律， 如可明确耐药结核分枝杆菌感染是否以外源性感染 为主，丰富理论知识，指导耐药性防治。2）通过对传染病重要病原体对主要抗菌药物及抗病毒药物的耐药机制的研究，特

21、别是对新耐药机制的研究， 可发现一些新的耐药基因或基因变异， 充实 耐药机制理论，如细菌对喹诺酮类抗菌药的耐药性也可由质粒介导。3）通过对抗耐药性新途径的探索性研究，可能会获得创新性发现如筛选有治疗意义的耐药真菌及抗 HIV 的新药靶、新药物，为耐药病原体的治疗开辟 新途径。2. 方法与技术方面：（1）建立 MIRIU 、PGRS 等方法，进行结核分枝杆菌的聚类分析，确定耐 药菌的来源。（2）与国外有关单位合作建立方法，以合成肽刺激体系及Tetramer 制备技术用于 HBV 耐药机制的研究。（3）在国内首次建立 HBV 表型及药敏测定方法。（4）建立高灵敏度的单一基因分子点突变检测技术（DB

22、SSM）测定HIV、 HBV 基因序列变异，提高检测水平。3. 科研队伍建设方面：（1）建立一支具我国特色的病原体耐药机制研究的科研队伍、密切各科研单位的团结、协作精神，进一步提升我国的科研水平。（2）培养100名左右具备现代分子生物学知识的病原体耐药性及耐药机制 研究的硕士、博士研究生。（3）每年在SCI收录的国际刊物上发表高质量的科研论文20篇以上，提升我国 科研工作者在全球的地位。三、研究方案总体设计思路按传染病的常见病原体：细菌、结核分枝杆菌、人类免疫缺陷病毒、乙型肝 炎病毒及真菌设置5个课题。各课题研究内容包括耐药性的分子流行病学、 耐药 机制及耐药性的形成及传播机制（包括新耐药基因

23、的研究）、抗耐药性的新途径 等方面。本项目的承担单位为国内在病原体耐药性研究方面具良好基础的科研单 位，其中包括数个国家或部委重点实验室。 因上述5个病原体的培养条件、生长 特性、抗感染药物的使用及耐药性特点等方面均截然不同，各研究者及多数实验室均仅对上述某一个或二个病原体具良好的工作基础，故按病原体来设置课题具较好的可操作性。结核分枝杆菌人类要传染病病原体课题一细菌耐药机制及其 耐药性防治研 究研究课题二 耐药结 核分枝杆菌的分 子流行病学及耐 药机制人类免疫缺陷病毒（HIV）课题三我国艾滋病病毒耐药性分子流行病调查和耐药机制研究乙型肝炎病毒（HBV）课题四 乙型 肝炎病毒的耐药机制研究r课

24、题五白 色念珠菌耐 药机制研究课题间的有机联系以及与预期目标的关系各课题间联系密切：细菌、结核分枝杆菌、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎 病毒及真菌均为传染病的主要病原体，只有对5个病原体的耐药机制进行全面研 究，才能了解传染病病原体的耐药全貌及共性， 达到控制耐药性的目标；每个 病原体均包含耐药性的分子流行病学、耐药机制及抗耐药性的新途径等方面研究最终阻止或大肠埃希菌内容；研究目标相同，均是通过病原体耐药性及耐药机制的研究, 延缓耐药性的产生与传播，提高传染病的治愈率。课题一细菌耐药机制及其耐药性防治研究主要研究内容：铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制、 对喹诺酮类抗菌药的质粒介导耐药机制及

25、 CTX - M型ESBL的来源及传播机制、 耐药菌的快速诊断及预防耐药性发生研究。目标：明确近年来新出现的细菌耐药性的形成和传播机制，及时、有效地控制耐药菌感染及耐药性的传播。承担单位：复旦大学负责人 王明贵（教授、博士），主要学术骨干：张婴元（教授、博导）、朱德妹（教授、博导）浙江大学医学院：主要学术骨干：俞云松（教授、博导）经费比例： 37。课题二 耐药结核分枝杆菌的分子流行病学及耐药机制研究主要研究内容： 我国耐药结核病分子流行病学特征及传播模式、 我国主要抗 结核药物耐药基因谱的绘制、 新耐药基因及耐药机制、 耐药基因型与表型的相关 性以及快速基因药敏诊断技术的临床应用评估。目标：明

26、确我国耐药结核分枝杆菌的分子流行病学特征及耐药基因谱， 有效 控制耐药结核病。承担单位：复旦大学 负责人 张文宏（副教授、博士）主要学术骨干：翁心华（教授、博导）、高谦 （教授、博士 ）杨燕萍 （讲师、博士 ）中科院上海生命科学院 张颖（研究员，兼美国约翰霍普金斯大学布隆博格公共卫生学院副教授）经费比例： 27。课题三 我国艾滋病病毒耐药性分子流行病调查和耐药机制研究主要研究内容： HIV 耐药性分子流行病学研究， 建立使用高灵敏度、 高通量的基因型测定准确预测耐药特性，分析 HIV 逆转录酶与核苷酸类似物复合物的 结构和功能，及其与细胞相关因子的分子作用机制，以 HIV-1 RT 的结构解析

27、为 基础提出对抗 HIV 耐药株的新靶位，包括细胞靶位并设计出 1-2 种新型抗病毒 药物，通过本研究提出我国艾滋病治疗临床药物的选择、 临床治疗方案的调整和 进一步优化方式。目标：系统地开展 HIV 耐药性流行病学调查和耐药机制的研究，为艾滋病 治疗提供新的抗耐药性途径，最终提出避免或减少 HIV 耐药的出现和流行的新 途径。承担单位：中国疾病预防控制中心负责人 邵一鸣（研究员、博士）主要学术骨干：张晓燕（副研究员、博士）、马丽英（副研究员） 、袁霖（助理研究员）中国科学院上海生命科学院 主要学术骨干：丁建平 （研究员、博士）张美兰（副研究员） 、祁维平（助理研究员）北京大学基础医学院 主要

28、学术骨干：高峰（教授、博士）鲁凤民（副教授），史宇晖（讲师，博士）经费比例： 15。课题四 乙型肝炎病毒的耐药机制主要研究内容：核苷类似物对 HBV 的耐药规律及其天然无应答性的原因、HBV 变异序列特异性细胞免疫反应的研究、对导致干扰素抗病毒治疗失败的宿 主因素进行分析、 建立并优化乙肝病毒表型耐药及药敏实验的体外鉴定系统、 临 床 HBV 耐药监测系统和网络的建立。目标：通过对 HBV 耐药规律的研究、耐药监测系统的建立，提高抗 HBV药物的临床疗效。承担单位：上海第二医科大学负责人 张欣欣（教授、博士）主要学术骨干：陆志檬（教授、博导）、龚启明（副教授）南方医科大学 主要学术骨干：温淑娟

29、（副教授）王战会（助理研究员）北京大学基础医学院 庄辉（教授，院士），李彤（副教授）李杰（副教授）经费比例： 13。课题五 白色念珠菌耐药机制研究主要研究内容： 通过分子流行病学调查， 耐药菌株基因变异分析， 明确我国 白色念珠菌耐药变异的特点及规律； 应用基因表达谱芯片杂交和蛋白质二维电泳 技术，结合生物信息学分析技术， 发现新的白色念珠菌耐药相关基因； 通过相关 基因缺失菌和高表达菌的表型分析， 分析白色念珠菌耐药相关基因功能， 并进 步阐明白色念珠菌耐药机制； 利用白色念珠菌耐药株和耐药基因高表达优势变异 株，筛选抗耐药白色念珠菌新化合物。目标：明确我国耐药白色念珠菌的分子流行病学特征及

30、耐药变异特点； 研究 新的白色念珠菌耐药相关基因及其功能， 进一步阐明白色念珠菌耐药机制； 建立 有效筛选抗耐药白色念珠菌新化合物的模型。承担单位：中国人民解放军第二军医大学 负责人 姜远英（教授、博导）主要学术骨干：顾 军（教授、博导）、曹永兵 （讲师、博士 ）经费比例： 8%技术路线1. 细菌耐药机制及耐药性防治1）多重耐药铜绿假单胞菌的耐药机制通过对碳青霉烯酶、 膜通透性改变及主动外排机制的研究， 明确多重耐药铜 绿假单胞菌的耐药机制，对新发现的碳青霉烯酶进行进一步的研究。1）碳青霉烯酶的研究：通过对碳青霉烯酶的筛选、酶特性及基因型分类等研究，了解产酶在耐药性形成中的作用， 与国外资料比

31、较， 了解国内细菌产碳 青霉烯酶特性；对新基因型进行基因定位（质粒或染色体） 、克隆表达、酶动力 学等研究。2）膜通透性研究：以聚丙烯胺凝胶电泳（SDS PAGE ）方法分析外膜孔蛋白的情况，与敏感株比较， 阐明外膜蛋白在碳青霉烯类抗生素耐药形成中的作 用。3）主动外排系统的研究：采用 CCC P抑制试验及外排泵调控基因 PCR扩增及序列分析方法明确外排表达状况。2）大肠埃希菌耐药机制研究1）大肠埃希菌对喹诺酮类的质粒介导耐药机制研究：质粒介导耐药基因 qnrA 及 qnrB 分子流行情况：检测 gnr 在患者临床分离株、健康人肠道、家禽、 家畜肠道中的分布， 明确质粒介导耐药机制在喹诺酮类耐

32、药性形成中的作用。 耐药机制研究： qnr 产物 Qnr 蛋白对喹诺酮作用靶位 DNA 旋转酶 A、B 亚基的 保护作用、 Qnr 作用位点和 Qnr 蛋白的模建及晶体结构的研究， 明确这一近年来 发现的耐药现象的形成机制。2）大肠埃希菌等革兰阴性杆菌 CTX - M型ESBLs的传播机制及传播规律: 国内的 ESBL 以 CTXM 型为主，通过对编码基因周围 DNA 的分析、 比较，了 解编码基因的起源及其传播规律。3）建立耐药菌快速基因诊断方法采用分子生物信息学技术， 研究病原菌的基因组序列或特征性基因序列， 种 属的保守区序列， 致 病基因 和 耐药基 因序列或特 征性的 基因序列等 ，

33、如 16SrRNA，23SrRNA，16SrRNA- 23SrRNA 基因区间的基因序列差异等。目标 是建立多重 DNA 引物的反应模式，可鉴别革兰阳性和革兰阴性菌的主要菌种 同时可以识别主要的耐药基因以及重要的耐药基因组 DNA 片断，以进行耐药谱 的测定，进而采用分子生物学方法直接从人体体液或相关标本中检测细菌的特异 性 DNA ，从而建立快速、准确的病原菌诊断方法。4）建立常用抗菌药治疗各种重要病原菌的“防突变浓度”范围 :拟采用体外模型测定抗菌药测定金葡菌、 肺炎链球菌和铜绿假单胞菌的 MPC 和“突变选择窗，”据此改进现有的给药方案，达到提高治愈率，减少耐药菌产生 的目的。2. 耐药

34、结核分枝杆菌的分子流行病学及耐药机制1）我国耐药结核病分子流行病学特征及传播模式的研究拟对我国华北与华东地区近 10 年来的结核初发病人菌株库进行 DNA 指纹 分析，同时对这些出发病人的耐药状况进行鉴定， 对主要抗结核药物耐药菌株的 主要耐药基因进行鉴定， 从而对耐药的进化特征、 聚集性特征和耐药基因分布特 征进行生物信息学分析。从而给出我国华北与华东地区近 10 年来的主要抗结核 药物耐药性的进化特征与耐药基因发生特征。 同时，我们还以华东地区 3 个区县 所有的菌阳结核病病人 （包括涂阳和涂阴病人） 作为样本，利用 MIRU 和 IS6110 -RFLP的方法鉴定所有菌株的基因型。结合流

35、行病学资料，分析结核病的流行 规律，建立以分子流行病学方法为基础的耐药结核病传播的规律快速鉴定平台。2）主要抗结核药物耐药基因谱的绘制及新耐药基因与耐药机制的研究在我国华北与华东地区耐药菌株分子流行病学研究基础上， 进行主要耐药基 因筛查，绘制我国耐药结核病相关基因与位点谱， 为分子生物学诊断方法的研制 奠定坚实基础。在筛查过程中发现当前耐药机制与耐药基因不能解释的耐药菌 株，作为新的耐药机制与耐药基因的目标菌株。 用 DNA 芯片方法筛查差异基因， 同时还利用蛋白质组学方法如双相电泳分析耐药菌株分泌蛋白和外膜蛋白中的 差异性蛋白，通过 N- 端氨基酸测序和肽质谱分析确定蛋白类别。依据结核杆菌

36、 比较蛋白质组分析及转录组研究结果，寻找相应数据库，确定 ORF 框及其在细 菌中的分布位置。 从而最终发现新的耐药相关蛋白与基因， 阐明新的耐药发生机 制。同时，对一些国外研究尚不深入的药物耐药机制进行研究， 争取发现新的耐 药机制或耐药基因。最后，采用knockdown等技术手段，研究所获得的基因（蛋 白）的功能，并初步研究它们作为治疗靶标的可能性。3）耐药基因型与表型的相关性以及快速基因药敏诊断技术的评估分析结核分枝杆菌临床分离株对 7种常用抗结核药物 （利福平、异烟肼、吡 嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素、喹诺酮类和卡那霉素）的耐药表型和基因型，了解两者之间的关系，确定发生耐药基因突变的最低抑

37、菌浓度（MIC）,进一步阐明 耐药形成机制。 以此为基础建立快速检测基因型耐药的方法， 采用前瞻性方法进 行肺结核和骨结核病人的临床治疗对照研究， 阐明其临床应用价值， 建立耐药结 核病人个体化的治疗方案。评估基因型耐药快速检测的临床应用潜力。3. 我国 HIV 耐药性分子流行病调查和耐药机制研究1）HIV 耐药性分子流行病学研究本研究利用已有的全国 HIV 耐药性调查网络，随机抽取计划用药者作为监 测对象，进行用药前、用药后每半年，一年、二年的队列随访研究。对所有样品 完成CD4细胞计数，病毒载量测定；套式PCR扩增HIV基因片断进行序列测定, 运用 GCG 软件包、 Clustal X、G

38、eneDoc 等序列排列和进化分析工具对测得序列 进行分析，并与美国 Los Alamos国家实验室 HIV Drug Resista nee Database数据 库以及Sta nford HIV Drug Resista nee Database数据库中序列进行比较以得到样本 序列与已知耐药序列的关联情况； OLA 实验检测已知与耐药密切相关位点是否deteetion of base发生耐药突变；以高灵敏度单一基因分子点突变检测技术（ substitution on a single molecule DBSSM）检测点突变，以最终确定病毒的耐药 基因突变位点，并与国外已有报道相比较，建立

39、适合于我国 HIV 流行特点的耐 药性检测技术和分析方法。同时，通过流行病学的调查，确定针对我国 HIV 流 行株的耐药株类型，基因型及表型的特点。2）对 HIV 耐药性出现、 发展进程与用药种类和剂量之间的关系进行研究通过对随访调查及测定样本的汇总分析，了解我国 HIV 治疗过程中耐药性 出现、发展进程与用药种类和剂量之间的关系； 通过体外药物压力筛选获得实验 室耐药株， 研究药物剂量与耐药株出现之间的关系， 药剂量与病毒复制抑制率之 间的关系；结合现场调查的数据，推测体内用药剂量，为当地一线药物选择、临 床治疗方案的及时调整提供意见。 在用药过程中测定用药前后多个耐药相关突变 位点在耐药病

40、毒株中的分布，并进行突变位点的连锁分析 （linkage analysis）， 进而确定病毒重组是否与多重耐药病毒的产生有关。 由于单一耐药基因在病人治 疗前就已存在， 本研究可回答在多种药物治疗的选择压力下， 是否不同的单一耐 药病毒发生重组，从而产生携带多种耐药突变的重组病毒的问题。3）野生型和突变型 HIV-1 RT 的结构和功能研究1）HIV-1 RT 与核苷酸类似物复合物的结构和功能研究研究 HIV-1 RT/DNA 在与核苷酸类似物（如 AZT 、3TC、PMEA 等）结合状 态下的结构，深入了解 HIV-1 RT 催化的 DNA 聚合的机理，获得在此复合物条 件下这些药物与它们相

41、应分子靶标的相互作用的信息。 同时，对于对核苷类似物 有抗性的 HIV-1 RT 突变体的结构解析还将使我们对抗药性产生的机理有所了 解。2）HIV-1 RT 系列突变体的结构解析以及它们与抗病毒药物结合状态下的 结构和功能研究通过野生型和本研究所获得的对核苷类似物及非核苷药物有抗性突变的HIV-1 RT的结构研究，获得更多的突变型HIV-1 RT及其与抗病毒药物复合物的 的结构，在三维结构水平上为我们揭示结构与活性间的关系以及药物抗性产生的 结构基础。而通过对最有效的抗病毒药物产生抗性的突变型 HIV-1 RT 在药物结 合状态下的结构解析，以期设计不易导致抗药性同时对已有抗药性的突变型HI

42、V-1 RT 高度有效的新药物。4）以 HIV-1 RT 的结构解析为基础的新型抗病毒药物的设计和最佳用药组成、抗耐药性途径研究通过分离获得的耐药毒株及序列分析结果找出病毒基因变异特点，结合非核 苷酸抑制物结合状态下的 HIV-1 RT 的结构研究为我们详细揭示抑制物结合口袋 的结构、各种抑制物的特点与性质以及抑制物与形成抑制物结合口袋的氨基酸的 相互作用方式。通过最大限度地增强药物与 HIV-1 RT 的保守区域间的相互作用所有已有的核苷酸设计新药将可以最大限度地降低这些药物导致抗药性的可能。类似物药物都有一个共同的特点， 即都有一个缺少 3'-OH 基团的糖基，而此 3'-

43、OH 基团在 DNA 聚合中对于引入下一个核苷酸是至关重要的。新药设计中，我们可 以对这些核苷酸类似物的其他的一些引起功能组分进行修饰， 如可以对糖基上的 其他基团进行修饰， 也可以对碱基、 三磷酸基团等进行修饰。 以期通过这些新的 修饰赋予这些新的核苷酸类似物 HIV-1 RT 高特异性，与对野生型和有抗性的突 变型 HIV-1 RT 的高效性。以上新药设计的研究心得， 结合现场耐药流行病学调查提出减少和避免耐药 性产生的有效途径，最佳用药途径，药物组成，为我国艾滋病治疗政策的制定， 临床药物的选择、临床治疗方案的及时调整提供意见。4乙型肝炎病毒的耐药机制(1) HBV 核苷类似物耐药发生规

44、律的研究选择接受核苷类似物治疗的慢性乙肝患者为研究对象， 研究治疗前后聚合酶 基因突变情况及其与血清生化指标、 病毒复制指标、肝组织病变程度之间的关系。重点研究那些临床出现耐药性表现的患者(如 HBV DNA 水平上升，转氨酶升 高)，初步筛选出可能耐药的患者。选择上述可能的耐药患者治疗前后血清为研 究对象，一步法扩增 HBV 全基因，转染 HepG2 细胞系进行病毒药敏试验， 对比 治疗前后 HBV 毒株的药敏结果，鉴定得到最终的 HBV 耐药毒株。分析以上研 究结果，总结出我国 HBV 耐药毒株的发生频率及规律。(2) HBV 变异序列特异性细胞免疫反应的研究阐明抗病毒治疗相关 HBV 耐

45、药变异是否穿越相关表位，是否可导致这些 T 细胞表位(特别是 CTL 表位) HLA 限制性的漂移，是否导致表位免疫显性的消长变化。表位分子免疫学特性的变化是否与不同患者抗病毒治疗应答的差异性相 关。选择 HBV 耐药重要热点变异序列，设计含有变异位点的多肽，应用合成肽 诱导刺激分离培养的P BMC，采用ELIS POT方法区分各合成肽诱导免疫应答的 能力，对可诱导免疫应答的合成肽进一步截短， 并比较截短肽中的免疫显性表位，Tetramer 鉴定表位的 HLA 限制性及其漂移情况， 同时进行特异性细胞毒 T 淋巴 细胞试验。ELIS POT通过定量分析IFN 丫等细胞因子的产量和活化 T细胞的

46、比例来显示某种表位的免疫能力及其变化。大多数活化后能够产生IFN 丫等细胞因子 的 CTL ，一般均具有对靶细胞的特异性杀伤活性；但也有一些研究表明，并非 所有能分泌IFN 丫的CTL均如此，故必要时应分析表位特异性 CTL的特异性细 胞毒活性。3）HBV 耐药毒株的生物学意义及特性在 HBV 全基因质粒的基础上，根据临床耐药患者血清中获得的 HBV DNA 序列分析的结果，通过定向点突变，获得不同的 HBV 耐药变异株，体外转染HepG2 细胞系，研究其复制、转录、各种抗原的表达分泌变化及病毒颗粒包装 情况，以及其他常见位点变异，包括 A1896位、BCP等对多聚酶耐药变异株复 制能力的影响

47、。同时构建中国株HBV （B和C基因型）重组杆状病毒HepG2细胞 系统，能编码不同病毒蛋白的临床耐药株和野毒株， 以此细胞系统用于耐药变异 株生物学特性的研究， 建立药物敏感实验、 交叉耐药试验和新药筛查的细胞平台。表型耐药测定利用所建立的细胞培养平台， 测定将病毒复制抑制 50%时所需的抗 病毒药物浓度（ IC50）。4）干扰素信号传导系统对抗病毒疗效的影响建立干扰素治疗的有应答和无应答的慢性乙型肝患者 EBV 转化 B 淋巴细胞系，同时收入健康对照， 体外不同浓度干扰素刺激后用凝胶电泳迁移率 （EMSA） 试验测定核转录因子ISGF-3和GAF，并用实时荧光PCR方法对干扰素诱导的 抗病

48、毒蛋白 MxA 、PKR、OAS1 等基础表达量、病毒刺激后、干扰素诱导下等情 况下的表达量进行定量。 主要通过干扰素信号传导途径异常的分析， 就宿主遗传 因素对干扰素治疗抵抗的影响进行探讨。5. 白色念珠菌耐药机制研究1）白色念珠菌耐药性的分子流行病学研究CYP51、1）建立我国白色念珠菌临床菌种库及其药物敏感性数据库，分析CDR1、MDR1、TAC1、CAP1 的表达差异，明确我国白色念珠菌耐药性形成的分子特点。2）收集不少于50对白色念珠菌耐药株及其亲本株样本， 用PCR法高保真扩增出CYP51、TAC1、CAP1基因，测序并与GenBank中基因比对；分析上述基因变异与耐药性分布和耐药

49、程度的关系，寻找靶酶基因和转录调控因子基因变异与选择压力的关系及常见的关键变异位点。2）白色念珠菌耐药相关新基因功能及耐药性形成机制研究1）利用基因表达谱芯片杂交、 蛋白质二维电泳技术， 结合生物信息学分析，研究上述 50对白色念珠菌耐药株及其亲本株的基因和蛋白质表达改变，寻找、发现新的白色念珠菌耐药相关基因。2）克隆新耐药基因，蛋白表达、分离、纯化，分析蛋白的功能。3）分别构建新发现耐药相关基因敲除的白色念珠菌及其高表达菌株，通过考察药物敏感性、耐药性形成、生物膜形成、菌丝形成、药物外排、靶酶活性、基因表达调控、生长周期及其他相关基因表达等表型的差异，明确新发现的耐药相关基因在耐药性形成中的

50、作用研究。3）抗白色念珠菌耐药性新途径研究1）利用耐药性白色念珠菌，从化合物库（第二军医大学自有）中筛选抗耐药白色念珠菌的新化合物，或氟康唑、伊曲康唑、两性霉素 B 等现有抗真菌药物的增敏剂。2）以耐药优势变异白色念珠菌为筛选模型，从化合物库中筛选抗耐药优势变异的新化合物3）以 CDR1 或 MDR1 高表达的白色念珠菌为筛选模型， 从化合物库中筛选CDR1 和 MDR1 的外排功能抑制剂创新点与特色1.利用分子流行病学手段，全面研究我国多种耐药病原体的耐药性产生及传播规律，通过对我国病原体的耐药特点、耐药基因变异及耐药基因谱情况的掌握，指导耐药性的防治。2.对传染病重要病原体进行数个全球创新

51、性的耐药机制研究，如对在我国发现的新耐药基因、耐药突变体进行进一步研究，将使人类对耐药机制有更深入的认识，充实耐药机制理论，如明确细菌对喹诺酮类的耐药性是否也可通过质粒介导，解释耐药性上升迅速的原因。3.通过本研究形成一些开创性的科学学说，如耐药结核菌感染的病原菌来源学说；HBV耐药变异可能导致“特异性T细胞表位HLA限制性漂移”学说等。4.应用分子生物学手段，进行耐药菌的快速诊断，提高疗效。5.开创性地进行抗耐药性的新途径研究，如在全球率先通过对HIV逆转录酶结构和功能的研究，筛选新型抗 HIV药物；筛选耐药真菌的新抗真菌药物。可行性分析1. 本项目参加单位均为在国内有一定名望、甚至在全球有

52、一定影响的实验 室，已经作了大量与本课题密切相关的前期工作， 所有参加单位均具有参与重大 国家科技计划如973计划、科技攻关计划、863计划的经验。2. 本项目参加单位均具有本研究所需的工作条件，包括较大面积的实验室（参与HIV、HBV及细菌研究的单位分别具有相应的 P3及P2实验室）、相应的 实验平台和大型仪器设备。3. 具有完备的科研梯队，包括学术带头人、学术骨干、中青年学术带头人 及实验技术人员，年龄结构上具有以中青年为主的老、中、青梯队。四、年度计划预期目标研究内容1.耐药病原体的分子流行病学研究:1.明确主要耐药菌特性、主要基因建立耐药病原体菌种库,分析主要型及其在细菌耐药性形成中的耐药基因型，基因分布,