A549DDP细胞凋亡与其机制的研究

1、A549/DDP 细胞凋亡及其机制的研究1 材料1.1 主要仪器 荧光显微镜及照相系统： Olympus 公司 垂直电泳槽： Bio-Rad 公司 电转移槽： Bio-Rad 公司 恒温摇床：江苏太仓仪器公司 分光光度仪： Bio-Rad 公司 遥控酶标仪： TECAN 公司 台式高速离心机： eppendorf 公司 其余同前两部分1.2 普通耗材50mL/250mL 细胞培养瓶： Nunc 公司6 孔细胞培养板： Costar 公司60mm 细胞培养皿： Costar 公司 细胞刮刀： Nunc 公司1.3 主要试剂Hoechst33258染色试剂盒：碧云天公司PI 和 Annexin V

2、-FITC :美国 BD 公司TUNEL 试剂盒：罗氏公司 鼠抗人 Caspase-8 p1（单抗：Cell SignalingHRP 标记羊抗鼠二抗：武汉博士德公司BCA法蛋白定量试剂盒：Pierce公司ECL发光检测试剂盒：Pierce公司硝酸纤维素转移膜（0.22卩m）Amersham公司DAB 北京中杉公司 其余试剂同前两部分1.4 常用缓冲液及培养基 结合缓冲液（X 10）： 100 mmol/L HEPES(PH 7.5) 1.4 moL NaCl 25 mmol/L CaCl2单去圬剂裂解液：50 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0) 150 mmol/L NaCl 1

3、%TritonX-100 100 g/mL PMSF 5X SDS 蛋白上样缓冲液：250 mmol/L Tris-HCl(PH 6.8) 10%SDS 50%甘油 0.5%溴酚蓝 500 mmol/L DTT（临用前现加）电泳缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 250 mmol/L 甘氨酸(PH 8.3) 0.1%SDS转移缓冲液：5.6 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 120 mmol/L 甘氨酸0.1%SDS 20% 甲醇(V/V) 储存于4C备用PBS缓冲液 137 mmol/L NaCl 2.7 mmol/L KCl 10.0 mmol/L

4、Na2HPO4 2.0 mmol/L KH2PO4调节至 PH=7.4洗涤缓冲液 (PBS-Tween-20)： 1000 mL PBS(PH7.4,0.01M) 500 a L Twe620封闭缓冲液：5 g 脱脂奶粉100 mL PBST 1.5细胞系同第一部分2方法 2.1 A549/DDP 细胞凋亡的检测2.1.1 细胞凋亡形态学观察 将 A549/DDP 细胞分别加入到含盖玻片的 6 孔细胞培养板中， 每孔细 胞数为1X 104个，培养过夜后，去培养液，加入含姜黄素终浓度为 0、5、10、20、30、40 a mol/L的培养液继续培养 24 h后终止培养,取出细胞爬片，按照Hoec

5、hst33258染色试剂盒说明书进行染色。 在细胞爬片上，轻轻滴加约 500 a L固定液，以刚覆盖爬片为宜,固定 10分钟。 去固定液，用PBS洗两遍，每次3 分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。加入0.5mLHoechst33258染色液,染色 5 分钟，用手晃动数次。去染色液，用PBS洗两遍，每次3 分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片, 让细胞接触封片剂，避免气泡。上荧光显微镜观察，激发波长 350nm,发射波长460nm。2.1.2原位末端标记（TUNEL）染色同上方法制备细胞爬片， PBS 洗涤， 4%多聚甲醛固定后， 按照

6、TUNEL试剂盒说明书操作。 在细胞爬片上，轻轻滴加约 500 a L固定液，以刚覆盖爬片为宜,固定 30 分钟。 PBS洗片两次，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。滴 加内源性过氧化物酶阻断剂（0.3%H2O2-甲醇溶液），室温孵育30分 钟。同上用 PBS 洗片，滴加通透液 （0.1%TritonX-100 溶于 0.1%枸橼酸钠溶液中 ），在冰浴中孵育 2 分钟。PBS洗两次,滴加50卩L的TUNEL反应混合液，湿盒中室温孵育60 分钟。PBS洗两次,50卩L的转化剂-POD,湿盒中37C孵育30分钟。PBS洗两次,加入DAB 底物溶液,室温孵育 10分钟。PBS洗两次,封片光镜

7、下观察。结果判定：细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。每张片至少观察500个细胞,计算每 100 个细胞内的阳性细胞,即凋亡指数 （apoptotic index,AI）。2.1.3流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬 液。接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL,细胞培养箱中过夜培养。 次日吸弃原细胞培养液, 加入含姜黄素终浓度为 0、5、l0、20、30、 40 a mol/L的培养液，继续培养 24h。 常规消化，4C离心（800rpm,5min）,收获各组细胞，转移至 1.5mL离心管。 弃上清，加入预冷的1X结合缓冲液100卩L

8、,重悬细胞，置于冰浴。加入5卩L Annex in V-FITC和5卩L PI于细胞悬液中，混匀，4C避光染色 10min。补加 490aL 结合缓冲液混悬细胞，立即行 FCM 分析。2.2姜黄素对A549/DDP细胞caspase-8的影响取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液,接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL，细胞培养箱中过夜培养。次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40 a mol/L的培养液，继续培养 24h。2.2.1 样品制备 提取细胞总蛋白：a.培养液中悬浮细胞蛋白的提取：各浓度姜黄素处理细胞24h后，终止培养

9、。将培养皿中的培养液转移至15mL塑料离心管中，4C, 2500rpm离心10min，弃上清，4C 1X PBS洗涤两次，加入单去污剂裂解液100卩L于冰上裂解30min,将上清转移至1.5mL塑料离心管, 备用；b.贴于培养皿上细胞蛋白的提取：4C 1X PBS洗涤培养皿两遍，加入单去污剂裂解液300卩L于冰上裂解30min。裂解完毕后，用细胞刮 片将细胞刮于一侧，转移至1.5mL塑料离心管中，4C, 12000r pm离心 10min。C.将离心后的上清液与从 a中得到的裂解上清混合，4C, 12000rpm离心5min,取上清分装于0.5mL离心管中，置于20C备用。BCA法蛋白定量。

10、取总蛋白含量相等的上清体积，加入 1/5体积的5X SDS上样缓冲液，沸水煮5min, 12000rpm离心10min，备用。2.2.2 电泳 采用微型垂直蛋白电泳系统进行 SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲系统为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。先后配制10%的分离胶及4%的浓 缩胶，凝固后用微量加样器向加样槽中加入样品和次高分子量蛋白质标准，电泳装置与电源相连，凝胶上所加电压120V，当染料前沿进入分离胶后，把电压提至160V，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶的底 部，关闭电源。2.2.3 转移 将电泳后的SDS-PAGE胶板置于转移缓冲液中平衡15min,再在转移缓冲液中进行电转移；将蛋白转移至硝

11、酸纤维素膜上，恒压60V，冷观察电转褪去染液却系统中转移2h。转移完成后将膜在丽春红染液中染色, 结果。剪下目的蛋白部分,做好标记,放入双蒸水中漂染, 颜色。2.2.4 Western blot封闭：将膜置于平皿中，加入封闭液于室温缓慢摇动1h。与一抗孵育：将鼠抗人 Caspase-8p10单抗及p -actin作为一抗用PBS稀释(1:1000)，与膜共同封入塑料袋中，4 C过夜。洗膜：将膜从塑料袋中取出，PBST振摇漂洗3次，每次10min。 与二抗孵育：将 HRP标记羊抗鼠抗体作为二抗用PBST稀释 (1:3000)，与膜共同封入塑料袋中，室温缓慢摇动 1h。 化学发光： 将膜上液体用滤

12、纸吸干， 置于化学发光底物反应系统中 反应5min,暗室X-光片15min。显影20sec定影10min. 扫描后，用LeicaQwin图象分析软件进行吸光度积分值分析。2.3 统计学处理 用 SPSS1 1 . 0统计软件包处理,统计学方法采用单因素方差分析,SNK-q检验，x2检验，PV 0.05认为有统计学意义。3结果 3.1 A549/DDP 细胞凋亡的检测3.1.1 细胞形态学改变 荧光显微镜下观察,姜黄素组部分细胞的细胞核均有破裂,呈大、小 不等,被荧光染料着色成致密浓缩发白发亮的细胞核, 此为典型的细 胞凋亡形态。其中以40卩mol/L姜黄素组最多，对照组只见很少凋亡 形态细胞

13、(附图 1)。3.1.2 TUNEL检测细胞凋亡指数原位 DNA 缺口末端标记染色, 凋亡细胞核呈棕黄色, 易于识别 (附图 2)。0, 5、10、20、30、40 a mol/L 的姜黄素作用于 A549/DDP 细胞 24 h后,凋亡指数分别是 (2.6±0.5)%、 (10.7±2.3)%、 (20.5±3.1)%、 (28.6±3.4)%、 (35.7±0.4)%、 (49.5±4.4)%,显示出明显的剂量依赖关系(Pv 0.05)。3.1.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 不同浓度姜黄素作用于 A549/DDP细胞24 h后，经

14、Annexin-V和PI进行染色后，用流式细胞仪分析凋亡细胞。流式细胞仪分析，获得由 四个象限组成的细胞直方图 （图 5）。第 1 象限代表细胞收集过程中出 现的损伤细胞（An-PI+），第2象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+），第3象限代表正常细胞（An-PI-），第4象限代表早期凋亡细胞（An+PI-）。本实验主要观察早期凋亡细胞，早期凋亡细胞即An+PI-细胞所占的百分比分别为2.93%、3.68%、7.71%、20.23%、 23.0%、 32.15%，显示出明显的剂量依赖关系 （Pv0.05）。3.2 Western blot 的结果 不同浓度姜黄素处理 A549/DDP细

15、胞24h后，出现Caspase8舌性裂解片段P10的蛋白条带（附图3）,且条带光密度积分值随姜黄素浓度 而增强 （图 6）。4 讨论 细胞凋亡是细胞生物体的一种重要的自稳机制， 是由体内外因素触发 细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。 研究表明， 肿瘤的发 生很可能就是由于细胞增殖和凋亡失衡， 导致肿瘤细胞无限无序增殖 所致。诱导肿瘤细胞凋亡是许多抗癌成分十分重要的抗癌机制之一。肿瘤化疗过程中， 凋亡细胞很快被体内的巨噬细胞清除， 对周围的炎 症反应很少。因此通过诱导凋亡而杀死肿瘤细胞具有更少的毒副反 应，目前通过诱导或促进肿瘤细胞凋亡正成为肿瘤防治的新思路， 也 是评估抗癌药物作用能力

16、的重要指标。 细胞发生凋亡时， 染色质会固 缩， Hoechst 染色细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。本部分 实验中，经 过不同浓度姜 黄素干预 24 h 后的各组细胞， 用Hoechst33258荧光染料染色后，在荧光显微镜下观察，姜黄素干预组均能找到较多胞核致密浓缩发白发亮的细胞， 并随着姜黄素浓度增加 而增多，而对照组只见很少呈凋亡形态的细胞， 这表明姜黄素可诱导A549/DDP 细胞凋亡。细胞凋亡时 DNA 断裂会产生大量游离的 3'-羟基末端，利用末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) ，无需 DNA 模板即可将生物素或地高辛标记的 外源性 dUTP 直接连接到凋亡细胞核的

17、DNA 断链的 3' -羟基末端，通过过氧化物酶标记的链卵白素或抗地高辛抗体与之结合，经 DAB显色，检测细胞细胞是否存在外源性核苷酸掺入的 DNA 片段，显示 凋亡细胞。 利用该技术能较准确地探测到细胞凋亡现象。 本部分实验 中，TUNEL结果示5卩mol/L姜黄素作用24h即有被标记染色阳性的 细胞出现，凋亡指数为 (2.6±0.5)%，与对照组相比有显著性差异。随着剂量增大，凋亡指数增多，凋亡细胞占总细胞数的比例升高。并且 阳性细胞数随药物浓度递增。流式细胞仪检测凋亡的 方法有 多种， 其中 磷脂结合蛋白AnnexinV-FITC/PI 双标记染色最为常用。 正常活细胞

18、带负电的磷脂酰 丝氨酸(P hos phatidylseri ne, PS定位于细胞膜内侧。细胞凋亡早期，由于细胞膜失去对称性， PS 从胞膜的内侧暴露于胞膜外，成为巨噬细 胞清除凋亡细胞识别的标志。 AnnexinV-FITC 是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白，与PS有很强的亲和力，可特异地与 PS结合。凋亡早期细胞仍保持膜的完整性， PI 不能进入细胞内， 而凋亡晚期和发生继发坏死的细胞可同时被 AnnexinV-FITC/PI 着色，利用流式细胞仪进行双参数分析，即可将凋亡细胞 （AnnexinV+ 细胞）与继发坏死的细胞（AnnexinV+/PI+细胞）区分开，并能计算出阳性细胞

19、百分率。本部分实验中，FCM分析显示姜黄素作用于 A549/DDP细胞24 h后,实验组的细胞早期凋亡率即明显高于阴性对照组，且呈剂量依赖性，这进一步证明姜黄素可以诱导 A549/DDP 细胞凋亡。 综上，本文从细胞形态， TUNEL 检测，流式细胞仪分析等三个不同层面证实了姜黄素可以诱导人肺腺癌 A549/DDP 细胞凋亡， 并呈剂量依赖性， 该凋亡的发生应该是姜黄素抗 A549/DDP 细胞增殖的主要途径。目前认为细胞凋亡通路主要有： 细胞外（死亡受体 ）途径、细胞内（线粒体）途径和内质网途径， 而天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 （cysteinylasp artate-s pecific p rotease,cas paSe的活化是不同细胞凋亡途径中共同的下游事件，活化后的cas pase通过切断与周围细胞的联络、重组细胞骨架、阻止 DNA 复制和修复、破坏 DNA 和核结构、诱导凋亡小体的形成等调控着细胞的凋亡过程。其中cas pase-8在细胞凋亡中起着极其重要的作用。caspase-8