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文档简介

1、谢谢观赏幽门螺杆菌工程疫苗研究进展幽门螺杆菌是慢性胃炎、 消化性溃疡及胃肠道淋巴瘤的主要致病因素, 并与胃癌发生密 切相关, WHO 将其列为第一级致癌物质,流行病学调查表明,我国是胃癌癌的高发区及 Hp高感染区,已对人民健康造成重大危害,尽管抗生素治疗在HP相关性治疗方面取得了较大进展。 但其毒副作用明显, 疗效不稳定, 无法解决其复发问题,人类与病原微生物的长 期斗争历史表明,医学教育 '网搜集整理有效控制和彻底消灭某种传染病的最佳途径是疫苗接种, Hp 疫苗接种将是预防 Hp 感染, 降低 Hp 相关性疾病发病率的最佳选择。 1995 年费城 会议上Rapuoli指出开发Hp疫苗

2、需要至关重要的三种成分:必须现能干扰粘附和毒性且 存在于所有菌株的保护性抗原。如尿素酶、热休克蛋白60、粘附素等;临床前试验需要能模拟感染和疾病的动物模型,一种新的 Hp 感染小鼠需要新鲜的临床分离株来感染小鼠, 这一模型能重复人体疾病的诸多临床表现, 如上皮细胞损害和炎症等; 需要有适用人体的 粘膜佐剂,比较肯定的有霍乱毒素B亚单位、大肠杆菌热敏毒素B亚单位等。1. 抗原基因的选择研究疫苗的首要任务便是寻找免疫原, Lazowskaetal 在 HP 蛋白免疫原的寻找方面作了较为出色的工作,最初应用全菌抗原和膜佐剂口服免疫Hp 感染的小鼠,成功诱导小鼠保护性免疫反应,医学教育 '网搜

3、集整理但全菌抗原成分复杂,副反应多,研 制 Hp 亚单位疫苗成为必然。 HpUre 基因组,由 A, B, C, D 四个亚基基因组成,基因结构 已清楚,其中 A , C, D 亚基免疫原性差,其免疫保护作用十分微弱,仅有 UreB 亚基能产 生保护性免疫, 是疫苗和诊断用抗原的主要候选基因之一; CagA 基因较大,编码分子量 94KD 的细胞毒性相关蛋白,是 Hp的主要致病因子。因此研究UreB或CagA相关的疫苗将能有效预防致病 Hp 的感染和发病, Ure 作为候选菌苗有许多优点:在菌株中含量丰富, 分布在细菌表面, 广泛表达和高度保守; 其大分子量和颗粒状结构 也更有利于粘膜免疫接种

4、。 Pappoetal 用纯化的 HelicobacterfelisUreB 亚单位和 CT 口服免疫 小鼠后可抗 Hf 定植,而 UreA 亚单位则无保护作用, UreB 亚互单位和 LT 口服免疫小鼠, 同样产生抗 Hf 感染保护力,重组的 Ure 和 LT 口服、鼻腔、直肠免疫同样能够诱导小鼠产 生免疫保护力,Ure抗体被动免疫小鼠后也能预防Hf感染的事实,间接说明 Ure诱导产生的免疫保护力是体液免疫应答介导的,螺杆菌属的 Ure 同源性非常高, HpUreB 亚单位和佐 剂CT 口服免疫小鼠可抗 Hf感染的事实,说明螺杆菌属的Ure存在交叉性表位,免疫后可引起交叉性保护,目前在小鼠模

5、型上已证实多种Hp抗原包括VacA,Ure,CagA,过氧化氢酶、 HpGroES 类蛋白等。都可诱导小鼠产生免疫保护力。疫苗能否清除已有的感染? Doidge 采用 Hp 超声裂解物和重组 UreB 亚单位,结合 CT 口服免疫慢性Hp感染小鼠,结果证实口服免疫兼具预防和治疗双重作用,Doidge在Hm感染的雪貂中也发现类似结果。 Ghiaraetal 研究了 Hp 相关抗原作为疫苗治疗慢性 Hp 感染效果, 同时也试验大肠杆菌突变脱毒肠毒素作为粘膜佐剂的可能性,结果表明不管是 Hp 超声裂解物或者重组蛋白 VacA和CagA,与UTK 63一起免疫,都成功地清除了小鼠体内已有的Hp,并且免

6、疫 3mo 后仍无感染, Marchettietal 实验了 LT, LTK 63佐剂与全菌、 内源性 VacA, Ure, CagA及重组VacA,CagA的免疫保护作用,发现都可激发小鼠产生免疫保护。2. 关于佐剂粘膜免疫需要强的佐剂以提高抗原的免疫原性,粘膜佐剂可刺激Th 2型粘膜免疫反应。 未来的 Hp 疫苗必须辅以能有效诱导粘膜免疫的佐剂,活化 Th 2 细胞免疫途径,才能产生大量的slgA,才能克服Hp抗原性弱的问题。CT和LT是目前研究最为深入的粘膜 免疫佐剂,它们都具有较强的粘膜免疫原性和粘膜佐剂效应,与不相关可溶性蛋白抗原同时口服免疫机体,能消除机体对这些免疫蛋白的耐受性,诱

7、导机体产生针对CT及其免疫蛋白的长期免疫记忆。它们都能促进抗原递呈细胞的抗原呈递,选择性诱导抗原特异性Th2 细胞应答,促进上皮内淋巴细胞的有丝分裂和B细胞种型分化,但由于CT 口服时在某些品系小鼠诱生超敏反应,而改用 CT-B 单位即可避免,故有人认为 CT-B 是至今为止最为有效最为安全的粘膜 免疫佐剂之一, 目前人们更为亲睐 LT-B ,因为 LT-B 较 CT-B 拥有更可靠的安全性和有效性, Michertietal 在临床实验了重组 HpUre 和 LT 口服免疫 Hp 染的志愿者的安全性和免疫原性, 结果发现治疗患者仅出现腹泻等, 较少的副反应; 而使用脱毒 LT 可避免以上副反

8、应。 LTK 63 与 LT 区别在于丝氨酸取代了第 63位的赖氨酸, LTK 63作为粘膜佐剂在动物模型上已成功诱 导抗原特异的体液免疫反应和风疹病毒特异的毒性淋巴细胞反应,因此LTK63 作为佐剂完全可能在未来临床中用于 Hp 治疗性免疫。最近 Kinetal 采用聚微囊包襄的全菌抗原口服免 疫小鼠同样可诱导小鼠产生强烈的系统和粘膜免疫,免疫8wk后,胃肠液中抗HPsIgA和血清 lgG 仍维持较高平, Hp 菌攻击小鼠保护率高达 95%,与 CT, LT 佐剂组对比无显着差异, 表明聚微襄颗粒可以诱导针对 Hp 特异系统和粘膜免疫, 并且可以作为未来 Hp 疫苗的佐剂。3. 关于疫苗蛋白

9、质分子的空间结构及抗原表位预测抗体分子在抗原上的结合位点称为抗原决定簇, 又称抗原表位。 它是蛋白质的表面性质, 常出现在分子的高暴露区域, 其性质、 数目及空间的构型决定其抗原特性, 为精确描述抗原决定簇, 可用同源蛋白质来评价特定氨 基酸替换的影响以确定抗原表位的所在区, 不过这里的表位是指 “功能表位 ”,即一种蛋白质 能在免疫检测中结合抗体的那一部分或片段、 因此研究某种蛋白质有意义的亚单位结构和功 能,它在实验使用上有买际意义。利用计算机软件可以预测蛋白质的空间结构和抗原位点,这可作为抗原多肽合成试验的选段参考,适当左右扩展成1020肽,也可用作抗原克隆表达实验前 PCR 引物设计时

10、模板范围选择的参考,使扩增出的序列能够覆盖较多的预测点, 这对我们研制 Hp 基因工程疫苗有重要指导意义。4. Hp疫菌的免疫保护机制免疫应答类型的确定直接决定人类疫苗学研究发展,Hp感染的免疫应答类型很难确定,这是因为自然感染Hp后,引起的免疫反应无保护性;而感染Hp 的啮齿类动物,采用经典免疫学技术很难分析疫苗的治疗性免疫应答机制。最近有报道 在Hp感染者胃粘膜中slgA水平明显高于对照组,提示粘膜slgA在抗Hp感染中具有重要作 用, Doigeetal 用 Hf 超声裂解物免疫小鼠,发现抗螺杆菌 slgA 水平与保护作用密切相关。 T 淋巴细胞在Hp感染中的保护作用目前知之甚少。Hp感

11、染患者外周血单核细胞的刺激和抑制作用已有报道,Hp感染的小鼠和人类,THI细胞被抑制,小鼠的保护性免疫与THi细胞抑制和 TH 2细胞活化密切相关。 目前 Hp 疫苗诱导机体产生保护性免疫和治疗作用的机制仍 不清楚,Ghiaraetal认为疫苗可能改变胃内Thl型应答反应,转变为 TH O或Th2型保护性反应;并且在慢性 Hp感染小鼠模型中出 TH!细胞反应口服Hp菌苗诱导THo或Th2细胞活化 反应,清除体内感染的细菌,Hp感染的小鼠模型研究发现 Th2反应刺激程度与胃粘膜内细菌减少和胃炎消退密切相关,Hp免疫小鼠体内发现IFN- 丫下清Thi反应,胃内Th2细胞分泌IL-4 水平增高;体外

12、培养 Hp 免疫小鼠后,发现大量脾细胞中有 Hp 特异 Th2 细胞,脾细胞 接种其他动物发现明显减少胃内 Hp 感染量。 Mohammadietal 也发现相似结果,并证明 IL-4 基因敲除小鼠体内 Hp 感染数量明显高于对照组,目前研究表明Hp 慢性感染人群 Thl 细胞反应占主要地位, 人类胃粘膜反应是否与小鼠相同?如果类似,采用无毒粘膜佐剂, 治疗性疫苗可能是清除 Hp 感染的新的方法。5. Hp 感染的动物模型 研制 Hp 疫苗的先决条件是必须建立合适、稳定的 Hp 慢性感染 动物模型, 以分析免疫应答和免疫保护机制。 在螺杆菌属细菌中, Hf 与 Hp 的生化特征和生 物学行为最

13、为接近,其16SDNA基因序列与Hp的同源性高达94.6% , Ure、过氧化物酶、过氧化氢酶均为阳性,生长条件相近,还具有相对较广的宿主范围,Hf 在小鼠胃内的定植无明显部位特异性,与人 Hp 胃内定植部位基本一致,并能引起与人类 Hp 相关胃炎相似的病 理改变。王继德博士 etal研究证实无特殊病原菌级Balb/c小鼠对Hf易感,25只小鼠的感染成功率为 100%,并能在胃内长期存活达 16wk 以上,用 ELISA 法在感染 16wk 以后的小鼠 血清、 胃肠液中可检出抗 Hf-lgG 抗体, 并发现该抗体与 Hp 抗原有明显的交叉反应, 这证明 两种细菌有许多共同免疫原, Hp 定植成

14、功的有悉生猪、 狗和无胸腺小鼠。 但这些动物昂贵, 需特殊饲养条件,且允许观察时间不足1mo,国内学者陈晶晶1990年最道了 Hp的wistar大鼠模型的成功复制,但不足之处在于Hp定植时间不超过1mo.有报道用灵长类动物复制Hp 模型,由于灵长类动物胃内生理结构与人类高度相似,可望获得长期感染,但该纯系动 物不易获得,饲养困难,价格昂贵。另外由于 Hp 的动物宿主谱较窄,其动物感染模型尤其 是常规小动物长期感染模型的建立,向未兄有成功的报道。故人们在研究中广泛应Hp的近缘菌感染小动物模型, Hf 小鼠模型是最常用的一种。6. Hp 减毒沙门疫苗 沙门菌是寄生于人和动物肠道的革兰阴性菌,它可以

15、作为其他病 毒、细菌、寄生虫等病原体的蛋白、抗原或表位的表达载体,向机体输送单价或多价抗原, 诱发系统免疫和粘膜免疫, 沙门菌通过其自然感染方式经过粘膜侵入呼吸道、 消化道、 雌性 生殖道等粘膜淋巴组织, M 细胞取和运输抗原。触发粘膜免疫反应,剌激 slgA 特异的 B 细 胞向其他粘膜组织迁移并分化成浆细胞,分泌 slgA 释放到粘膜表面, 防止病原体再度感染。此外沙门菌也可随血流分布到机体的肝、脾和淋巴结等处, 寄居在单核巨噬细胞中, 激发机体的免疫应答, 减毒沙门活菌疫苗表达的外源蛋白,无论采用口服免疫、鼻腔免疫、直肠免 疫或阴道免疫, 都能诱导哺乳动物产生显着而特异的免疫应答, 包括

16、全身和粘膜的体液免疫 应答。目前沙门菌载体菌苗系统常见的突变株包括: Ty21a, aro, asd, cya, crp 等突变株, 其中 aro 基因突变株不仅高度减毒,而且具有良好的免疫原性,被广泛用作表达多种异源抗 原的载体,而cya,crp突变株不仅减毒具有免疫原性,而且是双基因突变,回复突变的可 能性极小, 因此用该突变株作为载体菌苗很安全。 目前减毒沙门菌疫苗研究多利用其天然宿 主-小鼠来研究外源蛋白的免疫源性,人类应用减毒沙门菌疫苗也取得了令人鼓舞的成果, 目前Hp减毒沙门菌苗载体多为沙门菌突变株,如aro、phoPc等。Gomez-Durateetal用表达HpUreA,B亚单

17、位的减毒沙门菌 SL3261aro突变株,口服免疫 Balb/c, C57/B6小鼠,然 后用野生株攻击,免疫组获100%保护,对照组则无保护作用,血清、胃粘液中抗Ure 抗体均升高,说明减毒沙门菌能表达强免疫源性UrE.Corthesyetal用表达Ure的phoPc突变株鼻腔免疫小鼠也获得了满意的保护率,能诱导体液吏疫和细胞免疫,并刺激T 细胞增殖、分泌IFNy, IL-2.IL-4 , IL-5 , IL-6等细胞因子,说明沙门菌表达的Ure特异诱导了 Thb Th?等淋巴细胞反应。但是 Hp减毒活疫苗的研究尚有许多困难待克服:宿主对Hp减毒沙门菌苗的免疫应答机制及 Hp 菌逃避甚至破坏机体的免疫应答机制尚不清楚; 需进一步提高 减毒沙门活菌疫苗的安全性和免疫原性;研制稳定、高效表达Hp精制亚单位抗原的减毒沙门活菌疫苗。 Hp 感染与溃疡和胃癌的相关性己广为接受,耐药苗株不断增多以及发展中 国家 Hp 感染率不断增高的事实, 使我们只有寄希望于疫苗来根治和预防Hp 感染。 国外

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