71无菌检查法

1、V 71 无菌检查（USP29-NF24）这个章节的大部分内容都和欧洲药典或日本药典相应检测部分保持一致。有一些不一致的地方已用特殊标记（.）注明。下述步骤被用于检查药典中规定要求无菌的是否满足其专论中相应的无菌要求。供试品的性状允许时，可以采用供试品的无菌检查中的薄膜过滤法来检测。如果薄膜过滤方法不能 使用，贝慄用供试品的无菌检查中的直接接种法进行检测。所有的器具，除了标明的无菌器 皿外，都采用 直接接种法进行检测。重新检测的规定条款见 结果的观测和分析。因为无菌检测是一项非常严格的操作过程（必须保证无菌操作才能得到一个准确的检测结果），所以对操作人员进行相关的培训和鉴定是非常重要的。无菌检

2、查即在无菌状态下实 行。为了达到这个状态， 检测的环境必须适合无菌操作。要防止检验过程中暴露的微生物受污染。要对无菌检验的操作环境进行适当地取样检测和合适的控制来监控。不仅仅通过这些药典中的步骤就能确保一批产品无菌或已经灭菌。确认在无菌状态下操作或按无菌操作步骤操作则是首先需要的。当用药典中合适的药典方法检测产品中出现了微生物污染，其结果宣判该无菌检测所需方法无效，甚至是更换了操作步骤得到了不同的结果。额外的无菌检测信息，参见 V 1211灭菌和确保无菌概略培养基按以下处方制备培养基，或使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基，其能满足需气 菌，厌气菌，霉菌的增殖培养。培养基采用有效的程序灭菌。

3、下面培养基适合用于无菌检查。硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌气菌的培养。还用于需气菌的培养。大豆粉-酪蛋白消化物培养基 适合霉菌和需气菌的培养。硫乙醇酸盐流体培养基L-光胺酸2.5g氯化钠5.5g/5.0g葡萄糖(C6H12O6.H2O)0.75g琼脂，颗粒状（含水量不低于15%）5.0g酵母浸出物（可溶于水）15.0g酪蛋白胰酶消化物0.5g巯基乙酸钠或巯基乙酸酯0.3ml刃天青钠溶液（1 : 1000），现配1.0ml纯水1000ml取L-光胺酸，氯化钠，葡萄糖，酵母浸出物和酪蛋白胰酶消化物混合，加热直到培养基被活化。加入巯基乙酸钠或巯基乙酸酯，如有必要，加1N氢氧化钠，调节 PH值使灭菌

4、后为7.1 ± 0.2。如需过滤，加热培养基不需要煮沸，热时滤过滤纸。加入刃天青钠溶液,混合，马上分装至合适容器中，这样在培养期间最多培养上层基颜色发生变化。配制后采用有效的程序灭菌，培养基放于无菌密闭容器中，2。25°储存，如果上层超过三分之一的培养基变粉红色 ，培养基需水浴或蒸汽加热直到粉红色消失，迅速冷却，注意防止没有灭 菌的空气传入容器中。硫乙醇酸盐流体培养基 置32.5° ± 2.5°培养。选择性硫乙醇酸盐培养基配制与硫乙醇酸盐流体培养基相同组分的培养基，但不加琼脂和刃天青钠溶液，灭菌同 上，冷却。灭菌后 PH7.1 ± 0

5、.2。在厌氧条件下培养。选择性硫乙醇酸盐培养基 置32.5° 土 2.5°培养。大豆粉-酪蛋白消化物培养基酪蛋白胰酶消化物17.0g大豆粉木瓜蛋白酶消化物3.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖(C6H12O6.H2O)2.5/2.3g纯水1000ml在纯水中溶解固体，微温加热活化培养基。培养基冷至室温，加1N氢氧化钠调PH,调节PH值使灭菌后为7.3± 0.2。滤清，然后分装入合适的容器，除非需要马上使用，放于 无菌密闭容器中，2°25 °储存。青霉素和头孢菌素在这无菌检测培养基被用于 供试品的无菌检查中直接接种法，修改硫乙醇酸盐流体培

6、养 基和大豆粉-酪蛋白消化物培养基 的配制如下。无菌状态下在每个培养基容器中接种足够数 量的3 -内酰胺酶以抑制供试品中大量抗生素的活性，首先通过检验产品中含青霉素或头孢 菌素的抑菌活力以测定所需要的抑制抗生素活性的3 -内酰胺酶数量。笔记一充足的3 -内酰胺酶培养基也可用于薄膜过滤测试。在一个与无菌检测完全隔离的区域，确定合适数量的3 -内酰胺酶合并接种至培养基中，选择下面验证试验中任一种方法，用不到100cfu的金黄色葡萄球菌（参见表格1）做为挑战。 必须可清楚观察到被接种的培养基中有典型的微生物生长，用以确定3 -内酰胺酶的含量是 合适的。10表格1.增殖检测和验证试验中适合使用的微生物

7、菌株好氧菌金黄色葡萄菌1 ATCC6538, CIP4.83,NCTC10788,NCIMB9518大肠菌群ATCC6633, CIP52.62, NCIMB8054铜绿假单胞菌2 ATCC9027, NCTC10788, CIP82.118厌氧菌生抱梭菌ATCC19404 , CIP79.3,NCTC532 或 ATCC11437霉菌假丝酵母ATCC10231,IP48.72,NCPF3179黑曲霉ATCC16404,IP1431.83,IMI149007 1用大肠埃希菌代替金黄色萄葡球菌（ATCC6633） 2用藤黄微球菌（）代替生抱梭菌（ATCC9341 ）3用不产孢子的代替铜绿假单胞菌

8、 （ATCC8482 ）笔记-使用菌种培养保藏技术（菌种系统），使得用于接种的活性微生物由原来主要的菌种被转种不超过5代。适用性检查本检查可在产品的无菌检查前或与产品的无菌检查同时进行。无菌性确定每批无菌培养基无菌，取一定量培养基在特定的温度下培养14天。应无菌生长。好氧菌，厌氧菌和霉菌的增殖检测检测每批配置好的培养基，无论是脱水培养基还是按成分配制1。合适的微生物菌株在表格1中说明。接种小于100cfu生抱梭菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌于硫乙醇酸盐流体培养基 中培养。接种小于100cfu生抱梭菌培养物至选择性硫乙醇酸盐培养基中培养。分别接种 小于100cfu的黑曲霉，枯草杆菌和假丝酵母于

9、大豆粉-酪蛋白消化物培养基中培养，细菌培 养不超过3天，霉菌培养不超过 5天。如果可清楚地观察到有菌生长，培养基符合规定。储存如果配好的培养基保存于非密闭容器中，一般在1个月内使用，提供了两周内培养基增殖检测和颜色符合规定的检测。如果保存在密闭容器中， 一般可在1年内使用，提供了三个月内培养基增殖检测和颜色符合规定的检测。薄膜过滤法的稀释液、冲洗液稀释液A配制取1g动物组织胃蛋白酶消化物，加水1L,过滤或离心至澄清，如果必要，调节PH至7.1 ± 0.2。分装到容器中，采用验证合格的灭菌程序进行灭菌。青霉素和头孢菌素的配制如有必要，在溶解的供试品过滤后，在无菌状态下添加一些无菌的3

10、-内酰胺酶到上述准备好的培养基中，足以消除膜上残余任何抗生素的抑菌活性，（参见青霉素和头抱菌素培养基丿。稀释液D每1L洗液A加1ml聚山梨酯80,调PH至7.1 ± 0.2，分装在容器中，采用有效的程序 灭菌。这个稀洗液用于含有卵磷酯或油的物品，或标有“无菌标签”的设备。稀释液K取5g动物组织胃蛋白酶消化物，3.0g牛肉浸出物，10.0g聚山梨酯80混合溶于水中,加水稀释至1000ml。调节使灭菌后 PH为6.9 ± 0.2。分装到容器中，采用有效的程序灭菌。验证试验按产品的无菌检测法同样的方法进行检测，除了下面的修改。薄膜过滤法在添加要检测的容器中的样品至薄膜之后，在最后

11、一次用于冲洗滤器的无菌冲洗液中 加入一定量合适的微生物（不超过100cfu ）。直接接种法把要检测容器中样品（用于肠线和其它兽医用的外科缝合线）加至增菌培养基之后，加入一定量合适的微生物（不超过100cfu ）到培养基中培养。在两种情况下，用与需气菌，厌气菌和霉菌的增殖检测相同的微生物。制定一个增殖检测做阳性控制。所有含培养基的培养 物，培养不到5天。通常对照没有产品的控制容器，如果培养后可清楚地观察到有菌生长， 要么产品在该检验条件下不含有抑菌活性，要么这种抑菌活性被完全限制。不用进一步修改就可以进行无菌检查。如果在产品检测过程中没有清楚地观察到有菌生长，通常对照没有产品的控制容器，产品的在

12、此检验条件下抑菌活性没有被完全消除。为了消除供试品的抑菌活性，修改条件，并重新进行 验证试验。当（a）新产品需要无菌检测和（b）检测的实验条件 发生改变时，需要进行验证试验。验证试验可以和 供试品的无菌检查 同时进行。供试品的无菌检查样品的检验数量除另有规定外，每份培养基接种被检品的量按 表3所示。如果每只供试品的装量足够 （参 见表2）,等量加到专用培养基中。笔记-配制无菌实验用的两种或多种培养基。 如果每种 培养基最少检验数量不足，按表格3所示数量的两倍。表2.每瓶样品接入每种培养基的最少样品量每瓶含量最少检验数量（除非另有规定）液体制剂（不含抗生素 ）v 1ml全量1ml40ml半量，但

13、1ml40ml100ml20ml> 100ml取全量的10%，但20ml抗生素液体制剂1ml可溶于水或异丙基十四烷酸盐的供试品全量，但200mg混悬或乳化的乳膏，药膏> 200mg固体制剂v 50mg全量50mg300mg半量，但50mg300mg5g150mg> 5g500mg器具肠线和其它兽医用外科缝合线一根三段（每根 30cm）外科用敷料/棉花/纱布（成包）每包100mg缝合线和其它个别的包扎好单独用的东西整个材料其它医用器具整个器具，切碎或拆散开表3.与批产品的数量相比产品最少检验数量批产品的量用于每种培养基的产品 最小检验数量非肠道制剂< 10010 %或4个

14、（取较多者）100v N < 500 瓶10个> 500 瓶2 %或20个（取较少者）大容量非肠道制剂2 %或10个（取较少者）抗生素固体制剂配药散装包装（v 5g20瓶配药散装包装（5g）6瓶散装剂和混合剂参见桶装固体制剂眼用或其它非注射用制剂< 200 瓶5 %或2瓶（取较多者）> 200 瓶10瓶单剂量产品提供产品非肠道用记录器具肠线和其它兽医用外科缝合线2%或 5 件（W 20）< 100 件10%或4件（取较多者）100v N < 50010件> 500 件2%或20件（取较少者）桶装固体制剂4桶每桶4v N < 5020%或4桶（取较

15、多者）> 50桶2 %或10桶（取较多者）如果每瓶样品的装量按规定足够接种两个培养基，则由这个装量来确定所 有培养基需要的样品的量。用薄膜过滤法或直接接种法进行检测。包括合适的阴性控制。 供试品性状允许时用薄膜 过滤方法；就是说，用于过滤水溶性供试品，酒精供试品或油剂供试品和易混合的供试品。 可溶于水或油的供试品。这些溶剂在检验中没有抑菌活性。薄膜过滤法滤膜表面孔径不大于 0.45um，其作用是过滤截住微生物。例如，硝酸纤维素滤膜，用 于高浓度酒精溶剂。有的产品需要专门合适的滤膜（例如，抗生素）。下面方法所用滤膜大约直径50mm。如果使用不同直径的滤膜，稀释量和冲洗量都应相应调整。滤器和

16、滤膜用适宜的方法灭菌。过滤器的容量一定，并且滤膜无菌：它允许膜无 菌移动以改变培养基，并且过滤器可以加入培养基然后倒掉。水溶液供试品如果适当的，加少量合适的无菌冲洗液稀释液A （参见薄膜过滤稀释液和冲洗液）到滤器的滤膜上然后过滤，冲洗液可含有合适的中和剂和 /或适当的灭活剂，例如，为了避 免抗生素。添加样品到膜上，如果必要，用验证试验规定量的无菌冲洗液冲洗，但不少于表 2和表3中检验产品的数量。立即过滤。如果产品有抑菌，每次冲洗滤膜的量不少于验证试验用量的3倍。不需要每次 200ml冲洗5遍，尽管在验证中证明这个量不能完全消除抗菌 活性。把整片薄膜加到培养基上或无菌条件下平分，再把两瓣分别加到

17、两个培养基中。用与验证试验中相同量的各种培养基。反过来，也可加培养基到过滤器膜上。培养基的培养不少于14天。可溶于水的固体制剂（不包括抗生素）每种培养基中供试品量不少于 表2和表3所示，溶解于合适的冲洗液中，例如稀释液A （参见薄膜过滤稀释液和冲洗液）用密封式薄膜过滤器过滤，然后按上述水溶液供试品 项下的方法操作。油类和油剂供试品每种培养基中供试品加入量不少于表2和表3所示。完全低粘性的油类和油的溶液可以不用冲洗液而用干膜过滤。粘性油剂可用合适的无菌稀释液如没有抑菌活性的十四烷酸异 丙酯溶解。让油靠重量渗透膜， 施加压力或逐渐的吸力过滤。 适用性检查中用合适的无菌稀 释液，如加稀释液A （参见

18、薄膜过滤稀释液和冲洗液）含有浓度为10 g /L的乳化剂吐温 80 （稀释液K）冲洗薄膜，每次100ml至少冲洗3遍。把滤膜加入培养基中培养，按上述按 水溶液供试品项下的方法操作，并且培养的温度和时间都相同。油膏剂和乳剂每种培养基中供试品加入量不少于 表2和表3所示。脂肪型的油膏剂和水油型乳剂可以 用上述的十四烷酸异丙酯稀释至1%,如有必要，低于40C微温加热。个别情况不超过44C。马上过滤，检测步骤如上 油类和油剂供试品检查所述。预先装满的注射器对于预先装满的注射器，排出每个注射器中样品到一个或两个单独的薄膜过滤器中或添 加前先合并到单独的容器中。若附有单独的无菌的针头，同上直接排出注射器中

19、样品，然后 按水溶液供试品项下方法操作。用直接接种法检测针头的无菌性。注射用非抗生素固体制剂供试品按表格中所述混合检测样品，按 油类和油剂供试品项下方法操作。笔记-如果必要， 冲洗液可被加到混合物中帮助过滤混合的检测样品。注射用抗生素固体制剂配药散装包装，v 5g 从20个瓶中取，无菌条件下取300mg固体加到500ml锥形瓶 中，加200ml稀释液A （参见薄膜过滤稀释液和冲洗液）溶解，混合；或按表格所制定量， 20个瓶中各加一定量的稀释液或悬浮液，含有大约300mg的固体，加入500ml锥形瓶中，200ml稀释液A溶解，混合。按水溶液供试品或油类和油剂供试品项下方法操作。配药散装包装， 5

20、g从6个瓶中取，无菌条件下取300mg固体加到500ml锥形瓶中， 200ml稀释液A溶解，混合；或按表格所示量制定，每6个供试品加一定量洗液，含有大约1的g固体，加到500ml锥形瓶中，200ml稀释液A溶解，混合。按 水溶液供试品项下方法 操作。抗生素固体制剂，散装剂，混合剂无菌条件下从瓶中取足够用的固体制剂（参见表2）,混合后大约6g,加入500ml锥形瓶中。200ml稀释液A溶解，混合。按水溶液供试品项下方法操作。无菌气雾剂供试品将密封气雾剂中液体供试品置酒精干冰室-20 C冷冻1h。如果方便，无菌条件下容器开启前释放抛射剂，把供试品加入无菌锥形瓶中。加100ml稀释液D，慢慢搅拌。按

21、 油类和油剂供试品项下方法操作。标有灭菌标志的器具无菌条件下用不少于10个导管用量的稀释液D冲洗每个导管。把洗液合并加入无菌瓶中，按油类和油剂供试品项下方法操作。直接接种法将一定量表2和表3中所示量的供试品直接加到培养基中，除非另有规定，供试品的 量不多于培养基量的 10%。如果供试品有抑菌活性，加入合适的中和剂或使用足够量的培养基以消除抑菌活性。当需要用供试品的量比较大时，可以根据后来的冲洗液选择使用一定浓度培养基。合适浓度的培养基可直接加到供试品容器中。黏性油剂供试品适用性检查中，在培养基中加入一定浓度的乳化剂，例如0.1%吐温80。油膏剂和乳剂在无菌稀释液A （参见薄膜过滤稀释液和冲洗液

22、）中加入1/10的乳化剂，不含乳化剂 的冲洗过的供试品加到培养基中，培养至少14天。培养期间逐日观察培养基。每天轻轻摇晃培养基中黏油性供试品。 然而，当硫乙醇酸盐培养基合其它相似培养基用于检查厌氧菌时， 避免振荡或混合以保持厌氧菌的性状。肠线和其它兽医用外科缝合线将一定量不少于表 2和表3中所示量的供试品直接加到培养基中。无菌拆开包装，每个培养基中加入3段。切成开头，中间，末尾 3段，每段30cm长。从已打开的盒包装中取一 整段。每段加入选择性培养基中。使用的培养基足以浸没供试品（加20ml供试品到150ml培养基中）。固体制剂干的固体制剂供试品（或准备加了无菌洗液的供试品悬浮液），不少于 表2和表3中所 示的供试品的量，加到 200ml硫乙醇酸盐流体培养基中，混合。同样的，加相同数量供试 品到大豆粉-酪蛋白消化物培养基中，混合。检查同上。外科用敷料，棉花，纱布，和有关的供试品无菌条件下，从棉线，纱布，或大的外敷料中间部分按100mg至500mg量取两个或更多。单独包装，单独用的供试品，无菌条件下取整个。接种至每个培养基中。检查同