细胞培养室的建立与环境设计

1、细胞培养室的建立与环境设计细胞培养室是提供细胞生物学研究的基础实验室，有500m 2的实验场地，拥有4个层流的细胞操作间、6个普通培养操作间，及配套实验室和洗涤消毒室。主要设备：超净工作台 10台，forma细胞培养箱7台，普通倒置显微镜 8台，普通生物显 微镜5台，荧光显微镜-正置、倒置-各1台及照相系统一套（OLYMPUS ），显微摄象和 采图及分析系统1套，sigma离心机1台，sigma低温离心机1台，程序降温仪1台及相 应的配套设备。细胞培养室24小时开放，定期定时室内消毒灭菌。细胞培养室除提供细胞培养所需要的各 种工具、生物学试剂及细胞储藏，洗涤、消毒服务外，还提供技术指导、咨询，

2、定期为广大科研工作者开设技术讲座，开展技术经验交流活动。宽敞的细胞培养区普通细胞培养室内走廊普通细胞培养室一角万级层流细胞培养室、建细胞间的一些细节问题：1、甲醛薰蒸：40 %甲醛溶液（药用规格、福建三明化工总厂出品 ），用量30 ml / m3，室内温度2124 C, 相对湿度75 %85 %，加热薰蒸使蒸汽弥漫全室，关闭门窗1 h。甲醛水溶液为无色， 具有强烈刺激性气味的液体， 可杀灭多数微生物， 价廉，熏蒸消毒时不 损坏衣服、家具、皮革、橡胶等。市售的甲醛水溶液中一般含3740%的甲醛。其主要用法为：（1 ）熏蒸消毒 : 对室内消毒其用量为 2025% 毫升/米，在加热该溶液时最好同时煮

3、沸 一壶水，使室内相对温度保持在 70-90% 左右，室内温度最好在 20 摄氏度以上，作用时间 12-24 小时。如消毒皮毛服装，甲醛水溶液的用量可加至 125 毫升 /米,挂衣密度为每平方米3 套为宜。熏蒸消毒时应密闭门窗。消毒后一般多用自然通风驱散甲醛气体，其需时较长， 急于排出气体，可将 25%氨水加热蒸发中和。氨水用量为所用甲醛水溶液的一半，中和时 间为 30 分钟。（2）自然挥发 : 将较大量的甲醛水溶液放入一敞开容器中，室内温度保持在 18 摄氏度以上，同时室内喷水以保持相对湿度在 70%以上，经 16 小时可达到室内消毒的目的。 关于甲酸、甲醛和甲醇三者的毒性比较：甲酸的毒性比

4、甲醇大6 倍，甲醛的毒性比甲醇大30 倍。所以吃进 410 克甲醇，就能引起慢性中毒。它的毒性作用主要表现在损伤视力， 使视力减退（不能矫正），视野缩小，以致双目失明，直到死亡。2、关于紫外线：紫外线的穿透能力非常弱的， 主要靠电离产生氧自由基来消毒。 细胞培养室里面一些不能照 射紫外的物件可以用一般的材料盖住。 如：玻璃和有机玻璃都可以的。 紫外有些人认为大型 精密的显微镜是不可以照紫外的， 因为它们的镜头上涂的膜会被分解掉， 但我特意问了我校 光学系的老师，他们认为是没有关系的。此外， 不要担心紫外不能照射到的角落， 因为紫外杀菌功能除了紫外本身以外， 还可以由产 生的臭氧来完成。臭氧过量

5、吸入的作用应该和双氧水的作用是一样的， 个人认为也许有一定的致癌性。 所以紫 外灭菌以后，最好过一个小时再进去。3、关于新洁尔灭：【药品名称】苯扎溴铵溶液(新洁而灭溶液 ) (乙类非处方药【别名】BenzalkoniumBromideSolution 【标准来源】 中华人民共和国药典 2000 年版。 【性 状】 无色或淡黄色的澄明液体 ;芳香 ;味极苦 ;强力振摇能发生多量泡沫， 遇低温可能发生浑浊或沉 淀。【药物组成】每毫升含苯扎溴铵 0.05 克 (5%) 。【作用类别】皮肤科用药品。【药理 作用】 苯扎溴铵为阳离子表面活性剂类广谱杀菌剂。 【临床应用】用于皮肤黏膜和伤口的消 毒。【用法

6、用量】 外用，使用前应稀释即配即用。皮肤消毒使用0.1% 溶液；创面黏膜消毒用 0.01% 溶液； 稀释方法： 0.1% 溶液：取本品一份，加纯化水或清水 50 份； 0.01% 溶液： 取本品 1 份， 加纯化水或清水 500 份。【注意事项】 l. 本品为外用消毒防腐药， 不可内服。2. 不得用塑料或铝制容器贮存。 3. 涂布部位如有灼烧感、瘙痒、红肿等，应停止用药，洗 净。必要时向医师咨询。 4. 低温时，可能出现混浊或沉淀，可置于温水中加温，振摇使溶 解后使用。 5. 儿童必须在成人监护下使用。 【不良反应】 偶见过敏反应。 【药物相互作用】l. 不得与肥皂或其他合成洗涤剂并用。 2.

7、 局部消毒时勿与碘酊、高锰酸钾、双氧水、磺胺 粉等并用。 3. 如正在使用其他药品，使用本品前请咨询医师或药师。【规 格】 500 毫升:25克；100毫升：5克(5%)。【贮 藏】避光，密封保存。 评论：在甲醛灭菌前，先用新洁尔来擦洗整个墙面，此外，平时地板灭菌也可以用它。新洁 尔灭和酒精相比，最大的优点是便宜，因为新洁尔灭 500ml 只需 5 元，而且可以稀释 50 倍 用，而同样量的酒精价格可能是新洁尔灭的几十倍。二、培养准备时的一些问题：1 、多聚赖氨酸： 多聚赖氨酸溶液( Poly-L-Lysine Solution )Co nc.: 0.1% w/v, i n water Sto

8、rage: 18-26°CThimerosal, 0.01%, added as preservative多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂， 该多聚阳离子分子与组织切片上的阴 离子相互作用会产生较强的黏合力。适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理， 以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。使用说明 免疫学 操作步骤（可直接在玻片上涂布）1 灭菌的 ddH2O 1:10 稀释该多聚赖氨酸溶液。2. 用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26 °C3 将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液

9、5 分钟。注意增加时间不会提高包被效果。4 .在60 C烘箱1小时干燥，或室温18-26 C过夜干燥待用。 注意 1 每 100mL 已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片 40-90 张， 超过 90 张片子将影响其 黏合力。2 用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含 1% HCl 的 70%乙醇溶液来清洗。3 不要在用过的稀释液中加新的溶液。4. 释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8 C,至少在3个月内是稳定的。5 用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。2 、洗液的一些问题： 重铬酸钾硫酸洗液通常称为洗洁液或洗液，其成分主要为重铬酸钾与硫酸,是强氧化剂。K2Cr2O7 4H2SO4 K2SO4

10、 Cr2（SO4）3 3O 因其有很强的氧化力，一般有机物如血、尿、油脂等类污遗迹可被氧化而除净。事先 将溶液稍微加热，则效力更强。 新鲜铬酸洗液为棕红色， 若使用的次数过多，重铬酸钾就被 还原为绿色的铬酸盐，效力减小，此时可加热浓缩或补加重铬酸钾，仍可继续使用。配方：稀洗液 重铬酸钾 10g粗浓硫酸 200ml水 100ml浓洗液 重铬酸钾 20g粗浓硫酸 350ml水 40ml配法：先取粗制重铬酸钾 20g ，放于大烧杯内，加普通水 100ml 使重铬酸钾溶解（必要时可加热溶解）。再将粗制浓硫酸（200ml ）缓缓沿边缘加入上述重铬酸钾溶液中即成。加浓硫酸时须用玻璃棒不断搅拌，并注意防止液

11、体外溢。若用瓷桶大量配制，注意瓷桶内面必须没有掉瓷，以免强酸烧坏瓷桶。 配时切记，不能把水加于硫酸内（将因硫酸遇水瞬间产 生大量的热量使水沸腾，体积膨胀而发生爆溅）。使用时先将玻皿用肥皂水洗刷 12次,再用清水冲净倒干，然后放入洗液中浸泡约 2小时,有时还需加热，提高清洁效率。经洗液浸泡的玻皿，可先用自来水冲洗多次，然后再用蒸 馏水冲洗12次即可。附有蛋白质类或血液较多的玻皿，切勿用洗液，因易使其凝固，更不可对有如酒精、乙醚的容器用洗液洗涤。洗液对皮肤、衣物等均有腐蚀作用，故应妥善保存。使用时带保护手套。为防止吸收空气中的水分而变质，洗液贮存时应加盖。洗液具有强烈的腐蚀性，接触皮肤后会，皮肤会

12、变黄，2天后会脱一层皮。3、氟尿嘧啶：别名：5 氟尿嘧啶英文名：Fluorouracil （5 FU）。作用与用途：本品为嘧啶类的氟化物， 属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶 核苷核，干扰DNA合成。对RNA的合成也有一定的抑制作用。操作：在神经元培养时可以用来抑制胶质的生长。4、L-谷氨酰氨：资料：氨基酸是组成蛋白质的基本单位不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸 .其中谷氨胺是细胞合 成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡因此,各种培养液中 都有

13、较大量的谷氨酰胺但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20 C冰箱中保存，在使用前加入培养液内已含谷氨酰胺的培养液在4C冰箱中储存2周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺 细胞培养实验室环境设计1 实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响 .细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境清洁 ,空气清新 ,干燥和无烟尘 .细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内 侧, 常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室 .2 常用设施及设备(1) 超净工作台 :也称净化工作台 ,分为侧流式 ,直流式和

14、外流式三大类 .(2) 无菌操作间 :一般由更衣间 ,缓冲间和操作间三部分组成 .操作间放置净化工作台及二氧化 碳培养箱 ,离心机 ,倒置显微镜等 .缓冲间可放置电冰箱 , 冷藏器及消毒好的无菌物品等 .(3) 操作间:普通培养箱 ,离心机,水浴锅 ,定时钟,普通天平及日常分析处理物(4) 洗刷消毒间 :烤箱,消毒锅 ,蒸馏水处理器及酸缸等 .(5) 分析间:显微镜 ,计算机及打印机等 .3 培养器皿常用细胞培养器皿有培养瓶,培养板 ,培养皿等 .常准备量是使用量的三倍 .器皿应选择透明度好,无毒 ,利于细胞粘附和生长的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品.常用的器皿有下面几种

15、.(1)液体储存瓶 :用于储存各种配制好的培养液 ,血清等液体 ,常用规格有 500ml,250ml, 100ml 等几种 .(2)培养瓶 :根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异,用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀 ,便于细胞贴壁生长和观察 ,瓶口要大小一致 ,口径一般不小于 1cm, 允许吸管伸入 瓶内任何部位 , 规格有 200ml,100ml,50ml,25ml,10ml 等几种 .(3)培养皿:用于开放式培养及其它用途 .分直径 30mm,60mm,120mm 等几种 .(4) 吸管 :常用的有长吸管和短吸管两类 ,长吸管也称刻度吸管 .其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度

16、吸管用于移动液体常用1ml和10ml两种短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种(5) 离心管 :离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿 ,根据用途不同形态各样 ,常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类.前者分别为 50ml，30ml，15ml; 后者则多为 10ml 和 5ml.(6) 其它:如三角烧瓶 ，烧杯，量筒，漏斗，注射器等 .4 细胞培养温度维持培养细胞旺盛生长 ,必须有恒定而适宜的温度.不同种类的细胞对培养温度要求也不同.人体细胞培养的标准温度为36.5 C ±0.5 C ,偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡培养细胞对低温的耐受力较对高温强，

17、温度上升不超过39 C时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40 C 1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41 C 1小时，细胞 会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42 C 1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡， 个别细胞仍有恢复可能；当温度在43 C以上1小时,细胞全部死亡.相反，温度不低于0 C时，对 细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用；把细胞放入25-35 C时，细胞仍能生存和生长，但速度减 慢；放在4 C数小时后，再回到37 C培养，细胞仍能继续生长.细胞代谢随温度降低而减慢当温度降至冰点以下时 ，细胞可因胞质结冰受损而死亡.但是 ，如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂（二甲亚砜或甘油），可在深低温下如-80 C或-196 C （液氮）长期保存.5 合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一 ，所需气