紫外分光光度法操作规程

1、文件名称紫外分光光度法操作规程第6页，共6页文件编码BPZK3-SOP.F028版本号00紫外分光光度法操作规程文件编码BPZK3-SOP.F028版 本 号00代替文件紫外-可见分光光度法工作标准代替文件编码BPSOS02.069-00部门职务签名日期起草人QC室QC人员审核人QC室主管审核人QA室QA人员审核人QA室主管格式审核QA室文件管理员批准人质量部经理颁发部门质量部生效日期分发份数Copy 分发部门质量部QC室1 目的规范紫外分光光度法操作规程，确保紫外分光光度法操作规范化、科学化。2 范围适用于药品及药品生产用原辅料及其他物质的紫外-可见分光光度法分析。3 职责3.1检验员：负责

2、按本规程进行样品的紫外-可见分光光度法分析。3.2 QC主管、质量部经理：负责监督。4 内容4.1原理 紫外-可见分光光度法是通过被测物质在紫外-可见光区的特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。 定量分析通常选择物质的最大吸收波长处测出吸收度，然后用对照品或百分吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知物质定性可用吸收峰波长或吸收度比值作为鉴别方法；若化合物本身在紫外-可见区无吸收，而杂质在紫外区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰处无吸收，则可用本法作杂质检查。 物质对紫外辐射的吸收是由于分子中

3、原子的外层电子跃迁所产生的，因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环或发色基因，均可在近紫外区（200400nm）或可见光区（400850nm）产生吸收。通常使用的紫外分光光度计的工作波长范围为190900nm，因此又称为紫外-可见光光度计。 紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收区。朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律为光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量的依据，其数学表达式为： Alg=ECL式中 A吸收度； T透光率； E吸收系数； C溶液浓度； L光路长度。 如溶液的浓度（C）为1%（g/ml），光路长度（L）为

4、1cm，相应的吸收系数为百分吸收系数，以E1cm1%表示。如溶液的浓度（C）为摩尔浓度（mol/L），光路长度为1cm时，则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，以表示。 4.2仪器 紫外分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。4.3紫外分光光度计的校正和检定4.3.1仪器波长的检定4.3.1.1 用低压汞灯检定关闭仪器光源，将汞灯直接对准进光狭缝，如为双光束仪器，用单光束能量测定方式，采用波长扫描方式，扫描速度“慢”（如15nm/min）、响应“快”、最小狭缝宽度（如0.1nm）、量程0-100%，在200-800nm范围内单方向重复扫描3次，由仪器识

5、别记录各峰值（若仪器无“峰检测”功能，必要时可对指定波长进行“单峰”扫描）。如为但光束仪器，具体操作按仪器说明书进行。用于检定紫外-可见分光光度计的汞灯谱线波长：237.83、253.65、275.28、296.73、302.15、313.16、334.15、365.02、365.48、366.33、404.66（紫色）、435.83（蓝色）、546.07（绿色）、576.96（黄色）及579.07nm。4.3.1.2 用仪器固有的氘灯检定本法主要用于日常工作中波长准确度的核对。取单光束能量测定方式，测定条件同上述低压汞灯的方法，对486.02nm及656.10nm二单峰进行单方向重复扫描3次

6、。4.3.1.3 用氧化钬玻璃检定将氧化钬玻璃放入样品光路，参比光路为空气，按测定吸收光谱图方法测定。校正自动记录仪器时，应考虑记录仪的时间常数，测定样品与校正时取同一扫描速度。氧化钬玻璃在279.4、287.5、333.7、360.9、418.7、460.0、484.5、536.2及637.5nm波长处有尖锐的吸收峰，可供波长检定。氧化钬玻璃因制造的原因，每片氧化钬的吸收波长有差异，另外，在放置过程中也会发生波长漂移，因此需要定期由计量部门校验。4.3.1.4用高氯酸钬溶液检定本法可供没有单光束测定功能的双光束紫外分光光度计波长准确度检定用。使用高氯酸钬溶液校正双光束仪器，以10%高氯酸溶液

7、为溶剂，配制含氧化钬（HO2O3）4%的溶液，该溶液的吸收峰波长为241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。如果是双光束扫描仪器，但不是数据贮存型的，记录的波长可能因记录笔滞后而非真实波长，为了准确测定，建议采用定点检定而不同扫描方式。4.3.1.5仪器波长的允许误差为：紫外光区±1nm，500nm附近±2nm。4.3.1.6 可采用以上检定方法中的一种方法进行波长检定，我公司目前主要采用高氯酸钬溶液检定波长，每次检定后

8、填写紫外分光光度计校准记录(BPZK4-TR.109)。4.3.2 吸收度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。精密称取在120干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/L硫酸液溶解并稀释至1000ml，以硫酸液（0.005mol/L）为空白，在235nm，257nm，313nm，350nm分别测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，应符合下表的规定。波长，nm235（最小）257（最大）313（最小）350（最大）吸收系数（）的规定值124.5144.048.62106.6吸收系数（）的许可范围123.0126.0142.8146.247.050.3105.510

9、8.54.3.3杂散光的检查按下表所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，规定的波长处测定透光率，应符合下表的规定。试剂浓度/%(g/ml)测定用波长/nm透光率/%碘化钠1.00220<0.8亚硝酸钠5.00340<0.84.3.4 对溶剂的要求测定供试品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求；即用1cm石英吸收池盛溶剂，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质）测定其吸收度，溶剂和吸收池的吸收度，在220nm240nm范围内不得超过0.40；在241nm250nm范围内不得超过0.20；在251nm300nm范围内不得超过0.10；在300nm以上

10、时不得超过0.05。4.4 测定方法4.4.1通用操作方法：测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池，在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确，除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±1nm以内；否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度，并以吸收度最大的波工作为测定波长。一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.30.7之间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽度，否则测得的吸收度会偏低；狭缝宽度的选择，应以减小狭缝宽度时供试品的吸收度不再增加为准，由于吸收

11、池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。当溶液的pH值对测定结果有影响时，应将供试品溶液和对照品溶液的pH值调成一致。4.4.2 吸收系数测定（性状项下）按各品种项下规定的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，并计算吸收系数，应符合规定范围。4.4.3 鉴别及检查按各品种项下的规定。测定供试品溶液的最大及最小吸收波长，有的并须测定其在最大吸收波长与最小吸收波长处的吸光度比值，均应符合规定。4.4.4 含量测定4.4.4.1 对照品比较法按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成标示量的

12、100±10%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度：cx = （Ax / Ar）cR式中：cx供试品溶液的浓度；Ax供试品溶液的吸光度；cR对照品溶液的浓度；Ar对照品溶液的吸光度。4.4.4.2 吸收系数法按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸收度，再以该品种在规定条件下的吸收度计算含量。用本法测定时，吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。4.4.4.3 计算分光光度法采用计算分光光度法应慎重。本法有多种，使用时均应按各品种项下规定的方法进行。当吸收度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部

13、位测定时，波长的微小变化可能对测定结果造成显著影响，故对照品和供试品测试条件应尽可能一致。计算分光光度法一般不宜用作含量测定。4.4.4.4 比色法供试品本身在紫外-可见区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂显色后测定，这种方法为比色法。用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照品溶液同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸收度后，按4.4.4.1对照品比较法的计算供试品浓度。当吸收度和浓度关系不呈线形时

14、，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸收度，然后以吸收度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸收度在标准曲线上求出其含量。4.5注意事项4.5.1试验中所用的量瓶和移液管均应经检定校正、洗净后使用。4.5.2使用的石英吸收池必须洁净。当吸收池中装入同一溶剂，在规定波长测定吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配对使用，否则必须加以校正。4.5.3取吸收池时，手拿毛玻璃面的两侧。盛装样品溶液以池体积的4/5为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂，为防止溶剂挥发后溶质残留在池子的透光面，可先用蘸有空白溶剂的擦

15、镜纸擦拭，然后再用擦镜纸拭净。吸收池放入样品室时应注意每次放入方向不同相同。使用后用溶剂及水冲洗干净，晾干防尘保存，吸收池如污染不易洗净时，吸收池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则清洁液中的铬酸钾结晶会损坏吸收池的光学表面，并应充分用水冲洗，以防铬酸钾吸附于吸收池表面。4.5.4 测定前应先检查所用的溶剂在测定供试品所用的波长附近是否符合要求， 所用试剂应不超过其截止使用波长。每次测定是应采用同一厂牌批号，混合均匀的1批溶剂。4.5.5称量应按药典规定要求。配制测定溶液时稀释转移次数应尽量可能少，转移稀释时所取容积一般应不少于5ml。含量测定供试品应称取2份，如为对照品比较法，对照品一般也应称两份。吸收系数检查