鞘内应用Nω-硝基-L-精氨酸甲酯可抑制大鼠的热伤害反应

1、鞘内应用N-硝基-L-精氨酸甲酯可抑制大鼠的热伤害反应何农、徐秀征；北京大学首钢总医院麻醉科；薛富善；中国医学科学院整形外科医院麻醉科 摘 要目的：观察鞘内应用一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）对大鼠热刺激伤害性反应的影响。方法：将50只雌性大鼠随机平均分成5组，A组作为对照组，鞘内注射生理盐水；B组、C组、D组和E组作为治疗组，分别鞘内注射L-NAME 2.5g，25g，250g 和2 500g，在注药前以及注药后的60min内以5min的间隔采用热板测定大鼠的后爪退缩潜伏期作为热痛阈，并计算疼痛指数。结果：与鞘内注射生理盐水相比，鞘内注射L-NAME呈剂量相关性抑制

2、大鼠的热伤害反应。结论：NO在痛觉过敏的脊髓机制中具有重要作用。关键词 热痛阈；一氧化氮；痛觉过敏作者单位：100041 何农、徐秀征；北京大学首钢总医院麻醉科；薛富善；中国医学科学院整形外科医院麻醉科Intrathecal N-nitorarginine-methyl-ester administration on can reduce the nociceptive response to heat in ratsHe Nong，Xue Fushan，Li Ping，et al. Department of Anesthesiology，Plastic Surgery Hospital，C

3、hinese Academy of Medical Sciences，Beijing，100041.【Abstract】 Objective：To observe the effect of intrathecal administration of N-nitorarginine-methyl-ester（L-NAME），a non-selective nitric oxide synthase inhibitor，on the nociceptive response to heat stimulus in the rats. Methods：Fifty female rats were

4、randomly divided equally into five groups which received the intrathecal administration of different doses of L-NAME：Group A as control group，received intrathecal administration of normal saline 10g；Groups B，C，D and E as treatment groups，received intrathecal administration of L-NAME 2.5g，25g，250g an

5、d 2500g，respectively. The hindpaw withdrawal latency（HWL） as heat pain threshold，was measured with hot plate before intrathecal injection and every 5 min for the first 60 min after intrathecal injection. The algesic index（AI）was calculated. Results：As compared to intrathecal administration of normal

6、 saline，intrathecal administration of L-NAME in a dose-dependent manner reduced the nociceptive response to heat in the rats. Conclusions：Nitric oxide plays an important role in spinal cord mechanism of hyperalgesia.【Key words】 Heat Pain threshold；Nitric oxide；Hyperalgesia一氧化氮（nitric oxide，NO）作为体内的一

7、种重要细胞信使分子，广泛参与了中枢神经和周围神经系统的突触传递，并在调节脊髓神经元的“可塑性”方面发挥着重要作用1。但是，目前的大多数研究均是集中在组织炎症和神经损伤方面，而且是对NO合成底物和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制剂进行的定性研究，缺少剂量相关性研究。另外，目前有关NOS抑制剂对伤害性感受影响的研究结果也不一致2-5。本试验通过观察鞘内注射不同NOS抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）对正常大鼠热痛阈的影响，旨在探讨NO在脊髓痛觉调制机制中的作用。材料与方法鞘内置管方法 采用中国协和医科大学实验动物中心提供的体重为220310g的健康

8、雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，参考Yaksh等6提出的鞘内置管方法进行动物准备。通过腹腔内注射戊巴比妥钠50mg/kg对大鼠实施麻醉，麻醉效果满意后将动物置于俯卧位，在枕后正中部位切开皮肤，逐层钝性分离筋膜和肌肉组织，暴露枕寰筋膜。用尖刀挑破枕寰筋膜，见有清亮脑脊液流出后，将PE10导管向尾侧置入蛛网膜下隙，直至导管前端到达腰膨大部位，大约距小脑延髓池8cm。在头部固定好导管，逐层缝合切口。术后34天选取能正常进食、饮水而且无感染征象的大鼠进行神经功能测试，以行走正常、翻正反射良好且能以上肢扶笼站立者用于进一步的实验，而有任何神经损伤征象的大鼠则被筛除。大鼠的训练和筛选 对所有

9、大鼠首先进行5天的热板测试训练，以使动物对伤害性刺激的反应较为平稳7。采用热板测量痛阈，热板的温度维持在（52±0.2），测试大鼠的后爪退缩潜伏期（Hindpaw withdrawal latency，HWL），并将其作为大鼠的痛阈值。每次试验开始前将大鼠送入实验室内，在适应1h后，首先采用热板测痛装置测量HWL三次，每次间隔5min，取其均值作为基础值。剔除HWL大于10s和小于2s的大鼠，对反应良好的大鼠做下一步的实验。动物分组和实验处理选择合乎试验条件的大鼠50只，随机平均分为5组。通过预先放置的鞘内导管，采用微量注射器（50l）给大鼠注射下列药物：A组作为对照组，鞘内注射生理

10、盐水；B组、C组、D组和E组作为治疗组，分别鞘内注射L-NAME 2.5g，25g，250g 和2 500g。每组的注射容量均为10l，各治疗组的溶剂均为生理盐水。观察项目记录大鼠的基础HWL，注药后每隔5min采用热板测定HWL一次，直至60min为止。大鼠的热痛阈变化采用疼痛指数（algesic index，AI）表示，其计算公式如下：统计学分析 实验数据采用均数值±标准差（±）表示，采用SPSS统计学软件（10.1版本）进行数据处理，组间比较采用重复测量多因素方差分析和t检验，P<0.05为有显著性差异。结果鞘内注射生理盐水后，观察期大鼠的疼痛指数均无显著性改变

11、。与鞘内注射生理盐水相比，鞘内注射不同剂量的 L-NAME均使大鼠的疼痛指数升高。L-NAME的作用在给药5min后即可出现，并在35-40min时达到峰值。大鼠的疼痛指数升高呈剂量相关性，随着L-NAME用量增大，大鼠的疼痛指数升高越明显和药物的效应越强（图1）。讨论根据文献报道，在外周伤害性刺激下，脊髓后角NOS的含量及NOS阳性神经元数量明显增多8，9，表明NO在脊髓伤害性感受系统中具有重要作用。研究亦显示，NO在痛觉过敏发生中亦具有重要作用，例如鞘内给予NO合成底物L-Arg可引起甩尾潜伏期缩短、嘶叫等痛觉过敏反应；鞘内注射NO供体可使外周结扎坐骨神经所造成的痛觉过敏的开始时间提前，并

12、加速痛觉过敏的出现10。但是有关NOS抑制剂对伤害性感受影响的研究结果却不一致。有研究发现，在大鼠热甩尾实验中单独应用L-NAME并无抗伤害性感受作用2。然而其他研究则发现，L-NAME对持续性损伤所致的痛觉过敏有效3。有研究认为NO不但可影响急性热伤害性感受行为4，而且也可抑制福尔马林炎性疼痛大鼠模型的相疼痛行为5。这些不同的结果可能是与各研究在以下方面的差别有关：实验动物模型和试验方法；所用NOS抑制剂的类型；NOS抑制剂的给药途径和剂量。本研究结果显示，大鼠鞘内注射NOS抑制剂L-NAME可呈剂量相关性延长大鼠的HWL，并显著升高疼痛指数，表明NOS抑制剂具有抗伤害性感受作用，并可抑制痛

13、觉过敏的产生。这些结果说明NO在痛觉过敏的脊髓机制中确实具有重要作用。与既往研究的结果相一致3,4,10。关于NOS抑制剂抗伤害性感受作用的机制目前尚不十分清楚。众所周知，NO作为一种重要的信使物质可与cGMP一起构成细胞信号传导系统11。Xu等12发现，当鞘内应用L-NAME和甲基蓝抑制脊髓的NO/cGMP系统时，脑室内注射吗啡的抗伤害性感受作用增强，而通过脑室内注射给药方式抑制脊髓上NO/cGMP系统则不影响脑室内注射吗啡的抗伤害性感受作用。因此我们认为NOS抑制剂的抗伤害性感受作用有可能是通过脊髓的NO/cGMP系统实现的。N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体是中枢神经系统中兴奋性递质

14、谷氨酸受体的一种类型，研究证实，NMDA受体在神经系统的许多功能均是通过激活NOS（引起NO释放增多）介导的，例如伤害性感受和NMDA引起的痛觉过敏，而NO作为一种“逆行性”递质又可弥散至其他神经细胞调节NMDA受体的兴奋性13。研究发现，NMDA引起的NO释放可被NOS抑制剂所阻滞，并且脊髓NMDA诱发的痛觉过敏可被NOS抑制剂和环苷酸酶所抑制14。另外，NOS抑制剂对福尔马林炎性疼痛反应相反应的抑制作用亦是通过下调NMDA受体作用而实现的 15。因此我们推测，L-NAME的抗伤害性感受作用亦有可能与NMDA受体兴奋性的改变有关。在目前有关NOS抑制剂抗伤害性感受作用的研究中，尚无研究比较不

15、同剂量作用的差别，亦无研究证实其抗伤害性感受作用是否具有类似阿片类药物的“封顶”效应。因此在本研究设计时，我们按级数设计了4个剂量组，并且最大用量高达2 500g。虽然我们的结果显示鞘内注射L-NAME的抗伤害性感受作用呈剂量相关性，但却未证实其具有“封顶”效应。因此该问题值得做进一步的研究。总之，本研究证实鞘内注射NOS抑制剂L-NAME可呈剂量相关性抑制大鼠对热伤害性刺激的反应，这就从减少NO生成的角度进一步证实了NO在脊髓伤害性感受系统中的作用。另外，由于鞘内注射给药是临床疼痛治疗的有效途径，并且对NOS抑制剂的研究开发方兴未艾，所以本研究亦为镇痛药物的开发和有效镇痛途径的研制提供了理论

16、依据。参考文献1.Sousa A M, Prado W A. The dual effect of a nitric oxide donor in nociception. Brain Res，2001；897：9-19.2.Dambisya YM，Lee TL. Effects L-NG-nitro arginine methyl ester（L-NAME），L-NG-monomethyl arginine（L-NMMA） and L-arginine on the antinociceptive effects of morphine in mice. Methods Find Exp C

17、lin Pharmacol 1995；17：577-82. 3.Meller ST，Pechman PS，Gebhart GF，Maves TJ. Nitric oxide mediates the thermal hyperalgesia produced in a model of neuropathic pain in the rat. Neurosci 1992；50：7-10.4.Moore PK，Oluyomi AO，Babbedge RC，Wallace P，Hart SL. L-NG-nitro arginine methyl ester exhibits antinocice

18、ptive activity in the mouse. Br J Pharmacol 1991；102：198-202.5.Roche AK，Cook M，Wilcox GL，Kajander KC. A nitric oxide synthesis inhibitor（L-NAME） reduces licking behavior and Fos-labeling in the spinal cord of rats during formalin-induced inflammation. Pain 1996；66：331-41.6.Yaksh T L，Rudy T A. Chroni

19、c catherization of the spinal subarachnoid space. Physiol Behav，1976；17：1031-1036.7.Yu LC，Hansson Pm Lundeberg S. Effects of calcitonin gene related peptide 8-37 on nociceptive response in rats with inflammation. Eur J Pharmacol，1998，374：275-282.8.Meller ST，Dykstar C，Grzybycki S，et al. The possible

20、role of ganglion nociceptive processing and hyperalgesia in the spinal cord of the rat. Neuropharmacology，1994，33：1471.9.Steel JH，Terenghi G，Chung JM. Increased nitric oxide synthase immunoreactivity in rat dorsal root ganglion neuropathic pain model. Neurosci Lett，1994，169：81.10.Inoue T，Mashimo T，S

21、hibata M，et al. Rapid development of nitric oxide induced hyperalgesia depends on an alternate to the cGMP mediated pathway in the rat neuropathic pain model. Brain Res，1998，792：263-270.11.Tao YX，Johns RA. Activation and up-regulation of spinal cord nitric oxide receptor，soluble guanylate cyclase，af

22、ter formalin injection into the rat hind paw. Neurosci 2002；112：439-46.12.Xu JY，Tseng LF. Nitric oxide/cyclic guanosine monophosphate system in the spinal cord differentially modulates intracerebroventricularly administered morphine- and beta-endorphin-induced antinociception in the mouse. J Pharmacol Exp Ther 1995；274：8-16.13.Bredt DS，Snyder SH. Nitric oxide，a novel neuronal messenger. Neuron 1992；8：3-11.14.Davidson EM