毛细管气相色谱法测定血清非洛地平浓度

1、    毛细管气相色谱法测定血清非洛地平浓度        摘要采用毛细管气相色谱电子捕获检测器，以尼群地平为内标物质，对人血清中非洛地平的测定方法进行了初步的研究。实验结果，样品与内标的峰高比(Hs/Hi)同样品浓度间线性良好，线性范围0.540ng.ml-1，回归方程C=7.576Hs/Hi-0.0432，r=0.9989。最低检测限0.4ng.ml-1(信噪比31)；精密度试验，日内误差RSD6.3%，日间误差RSD7.5%；方法平均回收率为80.4%。结果显示，本法适

2、于血清中非洛地平原形药物的测定。关键词非洛地平，毛细管气相色谱，电子捕获检测器，人血清非洛地平(Felodipine)是二氢吡啶类钙离子拮抗剂，具有高度血管选择的药理特性，临床广泛应用于各类高血压病人。对于二氢吡啶类药物的定量方法，国外报道有气相色谱法，配合使用质谱测定器、电子捕获检测器、热导检测器或火焰离子化检测器；也有采用高压液相色谱法，配合使用分光光度法测定1；还有采用同位素标记法进行测定2。本文采用毛细管气相色谱配以电子捕获检测器，对人血清中非洛地平的测定方法进行了研究，报告如下。1方法和材料1.1药品和材料非洛地平标准品(河北医科大学合成提供)；尼群地平标准品(北京制药厂提供)；甲苯

3、(分析纯，重蒸馏)。1.2仪器VISTASP-6000气相色谱仪(Varian公司)；电子捕获检测器63Ni-ECD(Varian公司)；进样器：分流/不分流进样器(Varian公司)；SP4290积分仪(Varian公司)；色谱柱：SE-30石英毛细管柱，12m×0.3mm(惠普公司)；LD4-2离心机(北京医用离心机厂)；高速离心机(美国雅培公司)。1.3色谱分析条件采用不分流进样(1min以后分流)，进样器温度270；程序升温，初始温度150，保持2min，后以20.min-1的速度升到220，保持8min；检测器温度300，载气和补充气均为高纯氮气，柱头压力0.7kg.cm-

4、2，补充气流速30ml.min-1；进样量3l。1.4标准溶液和内标溶液的制备(1)贮备液：精密称取非洛地平标准品于容量瓶中，用甲苯配成500g.ml-1的贮备液；同法配制尼群地平200g.ml-1的贮备液，再用甲苯配成5g.ml-1的标准液。以上标准液均置于4冰箱避光保存。(2)标准溶液：取非洛地平贮备液逐步稀释成浓度为0.5，1，5，10，20，40ng.ml-1的标准溶液，分别加入5g.ml-1的内标溶液20l，使内标在标准溶液中浓度均为10ng.ml-1。以上标准液在冰箱4保存，供气相色谱用。1.5样品的预处理精密吸取健康人血清0.3ml，置刻度离心管中，加入10l适当浓度的非洛地平甲

5、苯标准溶液、10l内标溶液(相当于10ng.ml-1)、0.3ml蒸馏水、0.3ml甲苯，于振荡器上充分振荡萃取10min，10000r.min-1离心5min，-40冷冻2h后分取有机层，即可直接进样分析。2实验结果2.1血清中非洛地平的色谱见附。非洛地平与内标分离度R=1.732。附血清中非洛地平色谱(1)非洛地平(2)尼群地平2.2标准曲线以样品峰高(Hs)与内标峰高(Hi)的比值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标作。回归方程C=7.576Hs/Hi-0.0432，r=0.9989，线性范围0.540ng.ml-1(1.3104nmol.L-1)。2.3最低检测限该法最低检测浓度为0.4ng

6、.ml-1(检测量为1.2pg，信噪比为13)。2.4方法精密度配制高、中、低3种浓度的样品，同日内等间隔测定3次，计算日内相对标准偏差(RSD)；隔日重复测定3次，计算日间RSD(见表1)。表1日内、日间RSD测定样品浓度(ng.ml-1)日内(n=3)日间(n=3)±sRSD(%)±sRSD(%)50.77±0.056.320.75±0.067.53202.66±0.062.382.53±0.124.82405.06±0.234.595.09±0.061.222.5方法回收率取健康人血清0.3ml，分别加入已知

7、浓度的非洛地平甲苯溶液10l，使血清药物浓度相当于5，20，40ng.ml-1，按样品预处理项下操作，然后进行测定。3种不同浓度测得的平均回收率是80.38%，RSD为2.26%(见表2)表2回收率的测定投入量(pg)检出量(pg)回收率(%)(%)RSD(%)1512.2581.656048.7281.2080.382.2612093.9678.302.6分离度考察本试验使用SE-30毛细管柱，在其它条件不变情况下考察了不同终止温度下样与内标分离度的变化(见表3)。 表3终止温度对分离度的影响终止温度()分离度峰形2002.57宽峰2101.98较宽峰2201.73尖峰2400.99峰基有重

8、叠3讨论3.1非洛地平作为新型的心血管治疗药，其血中药物浓度很低，给药后吸收峰值一般在2040nmol.L-1(7.715.4ng.ml-1)，而且该类药物在进样系统及毛细管柱中易氧化，因此，对测定方法有较高的要求。3.2鉴于本法灵敏度较高，对试剂纯度要求相应亦高，将所用甲苯重蒸馏，可以减少样品峰前的杂峰干扰。在样品提取过程中，萃取混合及高速离心后，放置-40下低温冷冻，血清部分冷冻，从而与有机萃取相完全分离，这样适于样品量较少的提取分离，操作较为便易。3.3毛细管柱的选用对测定的影响很大。试验中我们通过对长度50(OV-1)、25(OV-101)、10m(SE-30)的3种毛细管柱分别考察，

9、发现选用SE-30毛细管柱较为理想，柱长缩短不仅使样品滞留时间缩短，而且受柱温影响较小，稳定性增加。3.4选择不同的升温程序，对样品与内标的分离有很大影响。实验结果发现，终止温度在200、210时，虽然样品与内标分离较好，但保留时间过长，峰形宽；终止温度在240，分离效果较差，并且由于柱温升高增加了不稳定因素；终止温度为220时，既可达到完全分离，又可保持尖锐的峰形，因此，认为此条件最佳。3.5本实验与国外文献同类方法进行比较，同为GC-ECD法，我们使用内标法定量，无需样品衍生化1或同位素标记24。实验结果，Anoff所做RSD为5%，最低检测限为0.40.8ng.ml-1，Larsson和

10、Regardh所做RSD为15%，最低检测限为0.5nmol.l-13.4。结果表明，本法适用于体内非洛地平浓度的测定分析，特别对本品的药动学研究有实用意义。作者单位：蒋燕萍张相林任家佩刘红星北京中日友好医院北京100029参考文献1M Ahnoff. Determination of felodipine in plasma by capillary gas chrom atography with electron capture detection. J Pharm Biomed Analys, 1984, 2:5192Edgar B, Regardh CG, Johnsson G, et al. Felodipine kinetics in healty man. Clin Pharmacol Therap, 1985, 38:2053Rutger Larsson, Bengt E. Karlberg, et al. Acute and steady-state phar macokinetics and antihypertensive effects of felodipine in patients with normal and impaired renal function. J Clin Ph