抑制一氧化氮合成对急性肺损伤炎症反应的调节作用

1、    抑制一氧化氮合成对急性肺损伤炎症反应的 调节作用         摘要：目的：研究抑制一氧化氮对脂多糖(LPS)诱导肺损伤炎症反应的影响。方法：ELISA检测TNF、IL-1、IL-6和IL-10浓度，Griess法测定亚硝酸盐浓度。肺湿干重比反映小鼠肺损伤程度。结果：小鼠腹腔注射LPS20mgkg后，血浆及肺泡灌洗液(BALF)中TNF、IL-1、IL-6、IL-10和亚硝酸盐浓度显著升高。LPS注射前30min给予地塞米松70mgkg，血浆TNF、IL-

2、1、IL-6、IL-10及亚硝酸盐浓度明显降低，而BALF中IL-1、IL-6、IL-10浓度明显降低。给予一氧化氮合酶抑制剂S-硫酸甲基异硫脲（SMT）85 mgkg，血浆IL-1和IL-6明显升高，BALF中TNF明显升高，而IL-1、IL-6和IL-10无明显改变。与LPS组相比，地塞米松组肺湿干重比明显降低，而SMT组相反。结论：抑制一氧化氮引起促炎性细胞因子释放增加，并加重肺损伤。关键词：一氧化氮细胞因子急性肺损伤Effects of nitric oxide inhibition on inflammatory response in acute lung injuryQiu Ha

3、ibo，Chen Dechang，Pan Jiaqi，et alDepartment of Critical Care Medicine，Nanjing Railway Medical College Hospital，Nanjing 210009AbstractAim：To observe the effects of nitric oxide inhibition on inflammatory reaction by lipopolysaccharides（LPS）-induced lung injuryMethods：The levels of tumor necrosis facto

4、r-（TNF），interleukin-1(IL-1），IL-6，and IL-10 in mouse bronchoalveolar lavage fluid（BALF）and plasma were measured by ELISANitrite was measured by Griess reactionIn animal model，the degree of LPS-induced acute lung injury was evaluated by the wet and dryweight ratio of lungResults：The levels of TNF，IL-1

5、，IL-6，IL-10 and nitrite in mice plasma and BALF after LPS 20 mgkg ip increased markedly at 12 hDexamethasone（Dex）70mgkg injected ip at 30 min before ip LPS decreased the concentrations of TNF，IL-1，IL-6，IL-10，and nitrite in plasmaBut IL-1，IL-6，and IL-10 decreased in BALFS-methylisothiourea sulfate（SM

6、T），a nitric oxide synthetase inhibitor，85mgkg injected ip at 30 min before LPS increased the levels of IL-1，and IL-6 in plasmaIn BALE，TNF increased，whereas IL-1，IL-6，and IL-10 remained unchangedCompared to LPS group，the wet and dry lung weight ratio decreased significantly in Dex group，but the ratio

7、 increased in SMT groupConclusion：Inhibition of nitric oxide may result an enhanced production of proinflammatory cytokines and an increased LPS-induced lung injuryKey wordsNitric oxideCytokineAcute lung injury目前，急性肺损伤仍然是危重病人的重要病死原因之一，深入探讨其发病机理和有效治疗手段具有重要的临床意义1。机体炎症反应失控是导致急性肺损伤的根本原因2。在复杂的炎症反应中，肿瘤坏死因

8、子（TNF）、白细胞介素1（IL-1）和IL-6是导致急性肺损伤最重要的促炎性细胞因子3。抑制促炎性细胞因子释放可能对控制急性肺损伤有益。一氧化氮是一种重要的自由基，参与机体复杂的生理过程。以往认为一氧化氮是促炎介质，参与组织损伤4。但最近的研究显示一氧化氮对急性肺损伤具有一定的保护作用。为深入探讨一氧化氮对肺损伤的作用，我们采用选择性一氧化氮合酶抑制剂，抑制诱导型一氧化氮合酶，观察其对促炎性细胞因子及肺损伤的影响。1材料与方法1.1材料脂多糖（LPS，EColi 0127：B8）、地塞米松和S-硫酸甲基异硫脲（SMT）购自Sigma。TNF、IL-1、IL-6和IL-10 ELISA试剂盒购

9、自Biosource。亚硝酸盐检测试剂盒购自邦定公司。昆明小鼠(雄性，1822g）购自中国医科院实验动物研究所。1.2方法通过LPS 20mgkg腹腔注射，复制小鼠急性肺损伤动物模型。动物分为生理盐水、LPS、地塞米松和SMT组。生理盐水、地塞米松和SMT组动物分别在LPS注射前30min腹腔注射生理盐水1ml、地塞米松70mgkg和SMT 85mgkg。LPS注射后12h处死动物，留取肺泡灌洗液(BALF)和血浆，待测细胞因子和一氧化氮代谢产物。BALF留取方法：动物处死后，切开颈部皮肤，分离气管，穿刺插入静脉留置针，生理盐水灌洗肺肺泡支气管，每次23ml，反复4次，将回收的灌洗液离心（20

10、00r×10min，4)，上清液分装。肺湿重干重比的测定：小鼠处死后，开胸取双肺，仔细切除肺外支气管和脂肪组织，秤重则为肺湿重，之后，将肺置入80烤燥箱中，干燥48h至肺脏恒重。秤干肺组织重量，则为肺干重。细胞因子测定严格按说明书操作。通过比色法(即Griess法）检测血浆和BALF中的亚硝酸盐浓度。统计学处理：数据以x±s表示，各组间比较采用t检验。2结果2.1地塞米松和SMT对肺损伤的影响LPS注射12h后，小鼠肺湿干重比显著增加。与LPS组比较，地塞米松组动物肺湿干重比显著降低，而SMT组显著升高（P0.05)(表1)。表1地塞米松和SMT对肺损伤湿干重比的影响（n7

11、，x±s）分组肺损伤湿干重比生理盐水3.96±0.52*内毒素5.95±0.99地塞米松4.54±1.06*SMT7.13±0.95*     与内毒素组比较，*P0.05 2.2地塞米松和SMT对促炎性细胞因子释放的影响与LPS组比较，地塞米松导致动物血浆TNF、IL-1、IL-6及一氧化氮浓度显著降低，同时BALF中IL-1、IL-6和IL-10浓度显著降低。SMT导致血浆中IL-1和IL-6浓度显著增加，但在BALF中，TNF升高，IL-1、IL-6和IL-10无明显改变(表2)。表2地塞米松和SM

12、T对促炎性细胞因子释放的影响（n5，x±s）分组TNF （ngL）IL-1 （ngL）IL-6 （ngL）血浆BALF血浆BALF血浆BALF生理盐水0*0*0.2±0.2*14.7±2.4*80.3±44.9*204.3±27.2*内毒素132.5±5.0229.3±20.3183.7±58.6168.8±41.93290.1±924.1374.8±233.7地塞米松72.8±20.0*216.0±65.90*57.9±8.7*67.6±45.

13、3156.8±93.6*SMT272.3±147.81128.6±336.9*228.5±36.8*250.9±113.75678.3±759.1*642.4±406.3     与内毒素组比较，*P0.05 2.3地塞米松和SMT对IL-10和一氧化氮释放的影响与LPS组比较，地塞米松和SMT均导致BALF中一氧化氮水平显著降低，但对血浆一氧化氮水平无显著影响。SMT导致BALF中IL-10显著降低，但地塞米松和SMT对血浆中IL-10释放均无明显影响(表3)。表3地塞米松和SMT对

14、IL-10和一氧化氮释放的影响（n5，x±s）分组IL-10 （ngL）亚硝酸盐（molL）血浆BALF血浆BALF生理盐水98.3±4.3118.9±27.1*8.8±5.0*7.2±1.4*内毒素277.4±164.1302±126.827.6±17.917.9±4.1地塞米松232.3±93.5168.5±38.8*15.1±8.212.4±7.9*SMT238.9±144.6265.3±48.716.1±11.013.1

15、7;2.5*     与内毒素组比较，*P0.05 3讨论本研究着重探讨了一氧化氮在急性肺损伤中的作用。肺湿干重比是反映肺毛细血管通透性的重要指标，一定程度上能够反映肺损伤的程度。本实验显示腹腔注射LPS后，急性肺损伤小鼠的肺湿干重比显著增加，血浆和BALF中TNF、IL-1和IL-6等促炎介质水平均显著增加，同时血浆和BALF中一氧化氮释放也显著增加。提示一氧化氮参与了急性肺损伤的病理生理过程。本观察显示抑制一氧化氮合成导致肺湿干重比显著增加，说明抑制一氧化氮可导致急性肺损伤恶化，提示一氧化氮对肺损伤具有保护性作用。这与以往的认识明显不同。本实验显示以

16、SMT选择性抑制诱导型一氧化氮合酶，BALF中TNF释放显著增加，血浆中IL-1和IL-6释放也显著增加。由此提示抑制一氧化氮合成，可导致TNF、IL-1和IL-6等促炎性细胞因子释放增加，相反，一氧化氮可能对促炎性细胞因子释放具有抑制作用。这一结果与Van Dervort的研究正好相反，他们发现一氧化氮对LPS诱导的TNF释放具有抑制作用5。当然，Florquin的研究支持我们的结果，Florquin发现抑制一氧化氮合成，可使B型肠毒素诱导的小鼠血浆TNF水平显著升高6。由此可推测，抑制一氧化氮合成导致的肺损伤加重，可能与促炎介质释放反馈性增加有关。IL-10作为一种抗炎介质，对促炎介质释放

17、具有抑制作用，防止促炎反应失控7。本研究显示小鼠腹腔注射LPS后，血浆和BALF中IL-10释放均显著增加。但值得注意的是，SMT抑制一氧化氮释放后导致促炎性细胞因子释放增加的同时，抗炎介质IL-10的释放并未增加，由此可能导致炎症反应失控加重，引起炎症性的自身性组织破坏，使肺损伤恶化。我们以往的研究发现，在体外抑制一氧化氮释放，并不影响TNF的合成8，这与本文在体内研究结果不一致。可能与在体内情况下TNF的释放受多种其它细胞因子和免疫细胞的影响和调节有关。地塞米松是一氧化氮合酶的强烈抑制剂9。本观察显示地塞米松对LPS诱导的肺损伤具有预防作用，血浆和BALF中TNF、IL-1和IL-6浓度显

18、著降低，说明地塞米松对肺损伤的防治作用与其抑制促炎性细胞因子释放有关。但非常有趣的是，地塞米松和SMT均对一氧化氮释放具有强烈抑制作用，但SMT可引起促炎性细胞因子释放增加，而地塞米松却对促炎性细胞因子具有强烈的抑制作用。可见，地塞米松和SMT对一氧化氮具有类似的效应，但对促炎性细胞因子具有不同的作用，其机制需进一步深入研究。总之，本研究显示抑制一氧化氮可导致促炎性细胞因子释放增加，进而导致肺损伤恶化。一氧化氮可能对急性肺损伤具有保护性作用。作者单位：邱海波，南京铁道医学院附院急诊科ICU210009 南京；陈德昌，潘家琦，刘大为，马遂中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院参考文献1Ber

19、nard GR，Artigas A，Brigham KL，et alThe American-European Consensus Conference of ARDS：definitions，mechanisms，relevant outcomes，and clinical trial coordinationAm J Respir Crit Care Med，1994，149：8188242Bone RCToward a therapy regarding the pathogenesis of the systemic inflammatory response syndrome：wha

20、t we do and do not know about cytokine regulationCrit Care Med，1996，24：1631723Shapiro L，Gelfand JACytokines and sepsis：pathophysiology and therapyNew Horizons，1993，1：13224Nathan CNitric oxide as a secondary product of mammalian cellsFASEB J，1992，6：305130585Van Dervort AL，Yan L，Madara PJ，et alNitric oxide regulates endotoxin-induced TNF production by human neu