QPCR定量简介

1、荧光定量PCR一、 原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就

2、有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。优点：重复性好，特异性高，灵敏性高，可多重PCR；缺点：只适合特定目标，价格较贵，本底信号较高。2）SYBR荧光染料： SYBR荧光染料是一种可以结合在DNA双螺旋小沟区域具有绿色激发波长的燃料。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。优点：引物设计方便，价格优势；缺点：特异性差，引物要求高，灵敏度差，不能进行多重定量。二、 内标在传统定量中的意义1几种传统定量PCR

3、方法简介： 1）内参照法： 在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。 2）竞争法： 选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知

4、模板推测未知模板的起始拷贝。 3）PCRELISA法： 利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCRELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。 2内标在传统定量中的作用 由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方

5、法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 三内标对荧光定量PCR的影响 1实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的： 1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（见图4） 2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始

6、模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。 2内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。 美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠

7、的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。 Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。 综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。正常情况下是不需要的，溶解曲线是在SYBR Green法中利用染料在DNA解链时释放不发射荧光，而在DNA双链时与其结合发射荧光的原理制作溶解曲线的，而Taqman探针在

8、PCR反应时其寡核苷酸链由于被DNA聚合酶的外切酶活性给切断，所以不能重新再结合故不能形成探针，所以不需要做溶解曲线。再一个，溶解曲线只是为反应体系中判断是否有非特异性扩增提供一个侧面的依据，适用于染料法。而探针法的特异性很高，从这方面来看也是不需要的。三、 常见名词定义Baseline本底信号：一般将前3-15循环的荧光值作为本底信号。真正信号：荧光信号超过阈值，进入指数扩增期时。荧光阈值的缺省值设置：一般将3-15循环荧光值的标准偏差的10倍。手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数扩增期的最初阶段。Ct值：荧光信号达到设定阈值所经过的循环数。起始模板浓度越高，Ct值越小，

9、Log起始浓度与Ct值呈现线性关系。理想PCR扩增：Xn=X0*2n 理想情况下扩增效率为2实际PCR扩增：Xn=X0*（1+En）n ，En为扩增效率，n为循环数，Xn扩增后产量；X0起始量。四、 常见值参考范围要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念我们需要首先明确，那就是荧光共振能量转移( FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体和能量受体对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(110 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。所以我们就检测不到它的荧光。TaqMAN

10、是一种水解型探针5端标记有荧光报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 ，即供体。3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光（荧光共振能量转移原理，FRET）Taq酶可水解探针。工作原理如下图：图1.探针法工作原理图2.燃料法工作原理相关系数R或复相关系数R2值显示实验数据满足衰减的线性程度，即数据的线性程度，线性用来衡量重复样品数据是否一致和不同拷贝数的初始模板是否具有相同的扩增效率。如果重复样品的Ct值明显不同的话，R 或R2值会变低，参考值R2值大于0.98，R大于0.99，越接近1，可信度越高

11、。扩增效率E参考值为0.9-1.2，扩增效率E=10-1/斜率-1，斜率参考值为-3到-3.5。探针引物设计见pdf格式参考文献。五、 分子信标荧光定量分子信标（molecular beacon）是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。并且不会产生荧光。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来,。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标

12、记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团：FAM ，Texas Red 。优点：对目标序列高特异性，检测SNP最灵敏的试剂之一，荧光背景值较低。缺点：只针对单一目标，价格较高，设计困难。六、 拷贝数计算待测样本浓度（ng/ul）=OD260*40*稀释倍数样本分子量=碱基数*324待测样本拷贝数（copie

13、s/ul）=待测样本浓度/样本分子量*6*1014七、 PCR反应体系中各种成分的作用1.10*buffer 用处：给TaqDNA聚合酶提供一个最合适酶催反应的条件。一般常用的10*buffer主要包括一下：Tris-HCl pH8.5 100mM、KCl 500nM、MgCl2 15nM。我们用的Buffer有时候会发现Mg2+ free，10*PCR buffer冷冻后，Mg2+会形成一个浓度梯度，所以使用时需要完全化冻并混匀离心后在使用。Tris -HCl缓冲液在PCR中使用1050mmol/L的Tris HCl缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。Tris缓冲液是一种双极化的离子缓冲液，p

14、Ka为8.3(20),pKa为0.021/。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20)时，在典型的热循环条件下，真正的pH值在7.86.8之间。KCl浓度K+浓度在50mmol/L 时能促进引物退火。但现在的研究表明，NaCl浓度在50mmol/L时，KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。2. Tween20 ：聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物，非离子去污剂，在做western blot时，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结

15、合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的标位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液。Tween 和同类型的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)非离子型去污剂在乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。离子型去污剂如SDS则破坏蛋白的结构。3. DMSO：二甲基亚砜，在使用Klenow片段进行PCR时DMSO是有用的；加入10%DMSO有利于减少DNA的二级结构，使（G+C）%含量高的模板易于完全变性，在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行，但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多数并不使用DMSO。4. betaine：glycine betaine，甜菜碱，降低二聚体的产生。对于长片段的扩增具有非常有效的增强作用，1mol/L到2.5mol/L甜菜碱对改进PCR扩增效果明显。5.ROX：内参，矫正系统误差，矫正每个孔