甜菜碱对脱氮假单胞杆菌发酵产VB12的影响(一)

1、甜菜碱对脱氮假单胞杆菌发酵产VB12的影响(一)王振国曹云峰陈学军李永亮李昆太张嗣良 摘要通过研究不同甲基供体(甜菜碱和氯化胆碱)对脱氮假单胞杆菌发酵产VB12 的影响，结果表明甜菜碱能显著促进 VB12 的生物合成；在此基础上考察了发酵培养基中甜菜碱浓度 对 VB12 合成的影响，结果表明 15g/L 的甜菜碱下 VB12 的合成量最高；进一步研究了甜菜 碱对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响，结果表明发酵液中一定浓度的甜菜碱可以显著提高&氨基乙酰丙酸的合成量，从而促进VB12 的合成。关键词甜菜碱；菌体生长；VB12 合成；氨基乙酰丙酸；脱氮假单胞杆菌 AbstractTheeffect

2、ofdifferentmethyl-groupdonors(betaineandcholinechloride)onvitaminB12productioninshakeflaskswithPseudomonasdenitrificanswasstudied,andtheresultsdemonstratedthattheadditionofbetainetothefermentationmediumcouldgreatlystimulatebiosynthesisofvitaminB12.Betaineconcentrationinfermentationmediumwasfurtherin

3、vestigatedinshakeflask,asaresult,15g/LofbetainewasthemostbeneficialforvitaminB12synthesis.Moreover,theeffectofbetaineonthefermentationofP.denitrificanswasstu died,itwasfoundthatthe -amirtolevulinicacid(ALA)biosynthesiscouldbesignificantlyimprovedwhenbetainewaskeptatcertainconcentrationinthebroth,thu

4、sthebiosynthesisof vitaminB12wasgreatlyi ncreased.KeywordsBetai ne;Cellgrowth;Vitami nB12bios yn thesis; -ami nolevuli r8cacid,;Pseudo mon asdenitrificans维生素 B12 (VB12)通常用来表示钴胺素类化合物，它是一种重要的生物活性物质，可以用 来治疗恶性贫血症，同时也是许多微生物和动物的生长因子1。自然界中，VB12 的生物合成存在两种不同的途径，即好氧途径和厌氧途径，但是VB12 的生物合成严格局限于一些微生 物 中 2 ， 目 前 用

5、于 商 业 化 生 产 VB12 的 微 生 物 主 要 有 谢 氏 丙 酸 杆 菌( Propionibacteriumshermanii )、 菲 氏 丙 酸 杆 菌 ( P.freudenreichii ) 和 脱 氮 假 单 胞 杆 菌(Pseudomonasdenitrificans )等。P.denitrificans 好氧合成 VB12 的途径已经详细阐明3。正是由于对 VB12 合成途径的了解，所以可以通过诱变和分子生物学等手段来改造菌株，已经 使得Pdenitrificans 菌株的 VB12 生产能力大大提高 2。由于 VB12 产率高，目前在工业生产中 几乎都是使用 P.

6、denitrificans 来作为好氧生产 VB12 的工业菌株。P.denitrificans 好氧合成 VB12 的过程一共需要 8 步甲基化 4。氯化胆碱(氯化-3羟乙基-N,N,N-三甲基铵)和甜菜碱(三 甲基甘氨酸)的每个分子含有三个甲基，它们通常作为生物合成VB12 的甲基供体。 White等 5第一次报道在 Pdenitrificans 中，甜菜碱-高半胱氨酸转甲基酶对VB12 的大量合成具有非常重要的作用。甜菜碱 -高半胱氨酸转甲基酶催化甜菜碱向高半胱氨酸转移一个甲基，分 别形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸6,因此甜菜碱在参与 VB12 生物合成过程中的甲基化具有非常重要的作用。 D

7、emain 等 7-9的研究表明，甜菜碱对 P.denitrificans 中 VB12 的合成和卟 啉的过量生成起着重要的作用。另外,甜菜碱是一种良好的渗透压调节剂10,有文献报道甜菜碱和胆碱能促进细胞表面对代谢产物的分泌，从而对细菌产VB12 具有刺激效果 11。甜菜碱在 VB12 发酵过程中具有非常重要的作用,但是目前很少有文献对甜菜碱所引起的 P.denitrificans代谢变化情况进行分析。本文主要考察了甜菜碱对 P.denitrificans 菌体生长和 VB12 合成的影响，并通过研究发酵过程pH 和氨基乙酰丙酸(ALA)合成量的变化，阐明了甜菜碱所引起的 Pdenitrifi

8、cans 代谢特征，为工业化发酵生产 VB12 中的甜菜碱控制工艺提 供了重要依据。1 材料与方法1.1 菌种和培养基 菌种：脱氮假单孢杆菌( Pseudomonasdenitrificans ),石药集团河北华荣制药有限公司。种 子培养基(g/L):蔗糖 40,酵母膏 10 ,NH4CI1.0,MgS04 7H200.5,ZnSO47H2O0.1, pH7.27.4。发酵培养基(g/L):蔗糖 80,酵母膏 30, (NH4)2HPO43.0, MgS04 7H2O2.0, CoCI26H2O0.1,5,6-二甲基苯并咪唑(DMBI) 0.05, ZnSO47H2O0.1, CaC031.Q

9、 pH7.07.2。1 .2 仪器与试剂仪器：8453 型紫外-可见分光光度计(Agile nt 公司)；HP1100 型色谱仪(Agile nt 公司)。试剂：氰钴胺对照品(含量99 %，河北华荣制药有限公司)，糖蜜(内蒙古兰田糖业有限公司)，甜菜碱(河北华荣制药有限公司),DMBI(河北科硕化工有限公司),CoCl26H2O(山东临县汇丰钴厂),ALA(Sigma 公司)，其他试剂均为国产分析纯。1.3 发酵培养方法 种子培养：用无菌水刮洗下斜面菌体,制成菌悬液。取 1ml 菌悬液接入装有 60ml 种子培养 基的 300ml 三角瓶中，30C, 260r/min 旋转式摇床振荡培养至菌体

10、吸光值(OD700)为 10 左右。摇瓶培养：300ml 三角瓶中培养基装量为36ml，接种量 10%,32C，于旋转式摇床(260r/min )培养至 96h。1 .4 测定方法菌体浓度(DCW):采用测量菌体干重法(drycellweight)。吸 10ml 发酵液，经离心和洗涤后， 菌体烘干至恒重，称菌体干重。VB12 测定：采用 HPLC 法。将被测样品中不同形式的VB12转化为氰钴胺，流动相：V (250mmol/L 磷酸水溶液)：V (乙腈)=30 : 70;色谱柱：大连依利特 HypersilNH2 柱(4.6mm 250mm,5m);检测波长： 361 nm ;进样量： 20

11、卩l流速：1.7ml/min。甜菜碱测定：比色法 12，利用甜菜碱与雷氏盐发生反应。卜氨基乙酰丙酸(ALA)含量的测定：按照文献 13的方法进行测定。2 结果与讨论2.1 两种不同甲基供体对菌体生长和VB12 合成的影响甜菜碱和氯化胆碱每个分子都含有三个甲基，常常作为发酵产VB12 过程的甲基供体。为了比较二者对 P.denitrificans 发酵产 VB12 的影响，在发酵培养基中分别加入10g/L 的甜菜碱、氯化胆碱,结果如图 1 所示：图 1 不同甲基供体对 P.denitrificans 发酵过程的影响Fig.1Theeffectsofdifferentmethyl-groupdon

12、orsoncellgrowth(solid)(a),brothpH(dash)(a)andVB12synthesis(b)ofP .denitrificansinshakeflask由图 1a 可见，发酵培养基使用甜菜碱的菌体生长量明显要高于使用氯化胆碱，其最大DCW分别为 23.04g/L 和 18.79g/L。使用甜菜碱作为甲基供体，发酵过程中的pH 较为稳定，一直维持在 7.0 左右。而使用氯化胆碱作为甲基供体,发酵液的 pH 急剧下降,第 48 小时后 pH 降低至 5.0 左右, pH 的下降很可能是由于氯离子积累而造成的。由图 1b 可见，使用氯化胆碱的 VB12 效价明显低于使用甜菜碱的VB12 效价，二者放瓶时(96h)的 VB12 效价分别为 20.75 卩 g/ml 和 48.45 卩 g/m。2.2 甜菜碱浓度对 VB12 合成的影响在发酵培养基中加入甜菜碱，浓度分别为0、5、10、15、20、30g/L。发酵 96h 后放瓶，结果见图 2。图 2 不同浓度的甜菜碱对 VB12 合成的影响Fig2.EffectofbetaineonthecellgrowthandvitaminB12biosynthesisofP .denitrificans从图 2 可以看出,在 P.denitrificans 发酵过程中,添加一定量的甜菜碱是十分必要的,它对 VB1