PCR技术检测种传植病细菌研究进展

1、PCR技术检测种传植病细菌研究进展1张卉1、2赵廷昌1李景富2孙福在1 刘学敏2回文广1张涛涛3（11中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京 10009421东北农业大学31北京市农林科学院植保环保研究所摘要本文综述了 PCR技术在种传植病细菌检测方面近年来的研究进展状况，对各种检测方法进行了比较详细的介绍，着重阐述了种类、原理、灵敏度等方面 的研究进展。关键词PCR种传病害细菌检测种传病害为通过种子携带传播的一类植 物病害1。病原体可以存在于用于 播种材料的表面、内部或内外兼存，有的则以病原体 直接混在种子之间。地球上90%左右的食用作物是以种子繁殖的，这些作物均受种

2、传病害的侵 害2。种带病原是很多农作物病害的重要初侵染源之一，是引起作物在田间和在贮藏期发病的祸根。种子携带并传播病害是很多地区发生新病害的原因。种传细菌性病害有74种以上3,理论上任何植物病原细菌都有可能由 种子传播。菜豆 晕疫病（Pseudomonas sy-r ingae pv. phaseolicola , 11万粒种子中若 有一粒带菌则 可使菜豆晕疫病发生流行造成 生产上的损失4、5。因此，加强种子检测以 减 少、减轻病害的发生是十分重要的。下面对PCR技术在种传细菌检测方面进行较 为详细介绍。1PC R技术在种传细菌检测中的应用 M ullis等在1985年创立的PCR方法 已成为

3、分子生物学及其相关领域的经典试验方法。此法灵敏、准确、方便、快 速，可在短时间内扩增出数百万个特异DNA序列的拷贝，目前研究人员已在检 测种子带菌方面应用PCR技术做了大量工作，设计得到了大量相关引物。例如， 用于检测菜豆晕疫病的引 物7,检测番茄细菌性溃疡病（CMM的引物等。多种以PCR为基础的分析 方法，比如，以rDNA为模板的PCR:ITS -PCR、tRNA -PCR 等都已经出现，利用特异引物的新方法 使细菌性病害检测能力得到加强。根 据PCR所扩增模板特点将PCR检测方法分类 如下。111用特定基因和DNA序列鉴定病害11111以致病性基因做目的片段使用特异引物PCR扩增与已知细菌

4、致病性相关的片段来检测和鉴定病害是很 有效的。例如,土壤杆菌属细菌（Agrobacter ium含有的染色体基因很复杂,可诱发 很多病害，这些病害的明显症状是由根瘤诱导质粒或根诱导质粒的存在引起的。测得这些质粒基因 序列，再找到相应引物进行扩增得到特异片段，达到检测目的。Haas等以高度保守的毒 性D2基因的内切核酸酶编码区 设计引物，特异性地检测 Agr obacter ium病原菌系。有 的引物可以用来扩增出编码果胶酶的 434bp的片段, 这一片段与软腐病菌（Erw inia carotovora引起的软 腐病相 关。有的引物1北京市自然科学基金（6012017、国家863（2001AA

5、249051和十五攻关资助项 目 收稿日期:2002-11-07, 2003-03-21 修回甚至根据控制果胶酶基因的不同序列可专一性鉴定亚种。包括黑腐变种（E. carotovor a pv. atr osep tia、软 腐亚种（E. carotovor a subsp. carotovora 山俞菜亚 种（E. caro -tovora subsp. w asabiae但不包括其它欧氏 杆菌（Erwinia种。还有的引 物可以检测出 马铃薯软腐病病原菌（E. chrysanthem i。目前，乙烯形成酶（efe基 因8,冠毒素生物 合成基因9都已被用作目 的基因来 检测病 害。11112

6、无特性DNA （Anonymous -DNA 作为扩增目标无特性DNA序列也可被用于设计PCR引物。经常可以用某一物种中特有的 DNA片段作为目标片段将其专一性地鉴定出来，这样的DNA片段序列就可以用于设计专一、灵敏的PCR基础上的检测方案。这样的 无特性DNA包括克隆的 RAPD片段、克隆的rep -PCR片段、负杂交片段、 插入元素和无特性探针。但 是这种目标序列对用于长期检 测可能不理想，因为对无特性目标序列的可 变性，稳 定性的研究工作进行的还很少。11113质粒DNA作为扩增模板需要注意的问题是，同无特性DNA作目的片段相类似的，除致病性特点外， 还要考 虑质粒基因作为目的片段的稳定

7、性。在有些情况下还要考察某一引物的适用范围。举例来讲，对于一个病原物种的检测有时只能检测到其中一部分，因为其 种内有些毒性菌系 不含目的质粒。对黄单胞杆菌属引起的菜豆疫病的检测就是这样。有的弓I物10只能检测到番茄溃疡病菌（Clavibacter michigane -sis subsp. m ichiganensis中75%的菌系。根据质粒Pcsl设计的类似启动 子序列的引 物对检测 马铃薯环腐病中有质粒的菌系具有 专一性，但对质粒缺乏菌系就检测不到了。但 一套根 据马 铃薯环腐病（C. m. subsp. sep edonicu质粒衍生物设计的特异性引物 可以检测到所有C. m. subs

8、p. sep edonicu菌系，包括一个用其它引物检测不到的可 能不含质粒的菌系。一种根据pEA29质粒序列设计的引物可专一敏感的检测梨 火疫病菌（Erw inia amylovora。所有 的被检 菌系都 含有这一目标DNA。这种质 粒也许与适应性有关，因此能够在自然生长的梨火疫病病 菌中存留下来。最后还 有一种情况11,在没有详细阐述基因及其产物的情况下,根据木薯枯萎病（X . c. pv. manihotis （种世界 范围的检疫对象 中与致病性相关的质粒片 段设计引物，从 107个菌系中都可以得到一个特异的895bp的PCR片段，而在5种木薯枯萎病菌 的非致病菌系及一些与这种黄单胞近

9、缘的或与木薯相关的其它腐生菌都没有扩增产物。所以质粒DNA可作为一种可靠的检测和鉴定病害相关的病原物的检测目 标。当然，掌握目标质粒DNA的本质特征和持久 性将对利用质粒DNA检测方案 的长期的可靠性大有裨益。112 以 rDNA 为模板的 PCR 分析 11211rDNA -PCR根据不同细菌的rDNA的不同特征有很多不同方案来对它们进行描述区分。 个别的细菌可能含有1（支原菌到14（梭菌属 个rRNA基因组，这些基因组不一定 都是同源 的。根据DNA保守区段设计的引物可用于 从一个大的系统发育不同的 细菌范围中扩增 核糖体基因片段。已有充分的事实说明植物病原细菌当中 由基因导致的rDNA特

10、异序列的存在 并针对假单胞杆菌属、 黄单胞杆菌属和许多检疫 对象设计了相关引物。 Widmer 等用一套具 有高度选择性的引物得到了假单胞杆菌 16s rRNA的基因片段。现已证 明用这些引物对 土壤假单胞杆菌的纯DNA进行PCR扩增是能够有效的得到目的 片段的。Maes等推出一套能够扩增一个对黄单胞杆菌特异的480 -bp的片段引物,通过结合一个通用的16s rDNA引物和一个对黄单胞杆菌特异的反向 引物能够检测小麦种子上的黄 单胞杆菌。T akeuchi等12测得6种布克氏菌和另 外两种相关细菌种的16s和 23s rRNA基因间的整个区 间序列并具此ITS带设计了专一性引物来检测水稻苗

11、期病害的菌原物水稻 谷枯病菌（B. plantar ii和水稻苗枯病菌（B. glumae。最近有 人利用16s rRNA基因中单碱基对变异连接酶连式反应来特异性的检测 斯氏细菌性萎蔫病病原 Pantoea （Er-w inia stew artii。rRNA基因已被用来作为检测目的基因 的DNA的高度敏感目标基因，但其区 分能力目前还在种或属的水平上。很多 PCR引物的特性使它们对其它PCR方案 都很适用,象特异性很高的ITS -PCR。11212IT S -PCR:转录间隔区-PCRITS -PCR分析利用根据保守16s及23s核糖体设计的引物来扩增转录 间隔区（ITS。在16s及23s

12、rRNA基因间 的ITS区间可能包括一些tRNA基因和 一些未编码区,因此较16s和23s rRNA基因本身变异要 大。用通用引物进行ITS -PCR时可以根据PCR产物的数量和 长度检测和区分细菌。如果从一种细菌中 扩增出的条带有变化,应是由不同rDNA长度变异引起的。实际上在 多rDNA基 因组中DNA的变异程度与近源菌系间的变异程度相等。可以通过限制性酶切分析ITS -PCR扩增产物或分析ITS扩增产物的DNA序列来增强特异性。Kim和Sony 13鉴定了 7种水稻病害病原菌,包括假单胞菌属、 黄单胞杆菌 属和欧氏杆菌属中的种。方法是：先用通用引物扩增,获得16s和32s rRNA基因

13、ITS -PCR产物,然后设计特殊引物专一性的扩增 ITS区。113tDNA -PCRtRNA -PCR方法是利用了 tRNA -PCR基因的固 有特性,tRNA基因常位于 16s和23s rRNA基因的ITS带或细菌5s rRNA基因末端。从被扩增区段外侧设计 一对引物对tRNA基因进行扩增，得到不同大小的扩增产物的指纹图谱，不同产 物的产生就是由属 或种的特异性造成的。Pan等结合tRNA引物Ala4和ITS的通 用引物L1,从甘蔗白条 病中扩增一个用于检测的360bp的片段,可以在待测样品 中含15CFU的情况下检出 病原物。2与免疫学技术相结合的PCR检测方法 医学免疫学及动物医学免疫

14、学的不断 发展促进了血清学技术用于植物病原细菌的检测研究。应用血清学技术检测植物 病原细菌 发展至今，对于植物病原细菌的检测已是一 种较为成熟的技术。目前 血清学技术与PCR相结合应用于病原细菌的检测，提高了检测的灵敏度。主要 有两个大的方向：211 免疫 PCR (Immu no -PCR免疫PCR技术是1992由Sano T.等14最早使用的。该技术将血清学中抗原 - 抗体反应的特异性与PCR的强特异扩增能力结 合起来，可以在短时间内精确的检 测某一病 原物是否存在。免疫PCR的原理是：用一段具体的DNA分子标记抗体, 应用此抗体去检测抗原,PCR扩增此段DNA分子,根据扩增产物存在与否判

15、断抗 原是否存在。一般的 操作过程是：在酶联板内包被用于捕获抗原 的抗体，加待检 抗原,再加DNA标记的抗体,然后PCR扩增抗原抗体复合物上的DNA片 段，根据电泳结果判断抗原存在情况。此种做法类似于ELISA中的双抗体夹心 法。根据反应物的不同,目前可将免疫PCR分为单分析物免疫PCR、多分析 物免疫PCR、单引物免疫PCR、和双引物免疫PCR。 212免疫磁性分离-PCR (IMS -PCR 磁性免疫微球(immunomagnetic micro -sphere -IMM S是近年发展起来的一类新型 功能性材料,它是磁性微球载体表 面通过化 学或物理方法连接上具有一定免疫活性的物质作为配体

16、而研制成的。由于磁性微球粒径一般很小，比表面积大，故而偶联容量较高，悬浮稳定性较好，便 于各种反应高效而方便 的进行；又因其具有顺磁性，在外电场的作用 下固液相的 分离十分简单，可省去过滤、离心等繁杂操作，并可在磁场作用下定位，方便地进 行分离同配体相对应的物质。目前免疫磁性分离技术已应用于细胞标记、细胞分 离、临床PCR检测等方面1516。应用于种子带菌检测的具体做法是：包括于 IM MS上的抗 体选择性吸附目标菌，洗掉未吸附的污染物（土壤颗粒、植物残渣 和非目标菌；然后对目标菌扩增培养（此步也可省略，进行PCR扩增目的片段，根 据所得结果判断目标菌是否 存在。IMS -PCR的特点是对目的

17、菌进行了二步检测 一是血清的作用，二是PCR的作用。这样在保证了检测速度的情况下，提高了检 测的可靠性。在检测西瓜细菌性果斑病 的试验中R. R. Walcott等证明了 IM S - PCR的灵敏度 比直接PCR高100倍,而 且不受PCR抑制因子的影响。3展望随着国际贸易自由化程度不断加深，国际间农产品的交易日渐频繁，种子的进 出口检疫工作显得日益重要。在这一方面，我国着实应当向发达国家学习，加强种 子检疫研 究。传统的检测方法，如：解剖检测法、洗涤检测法、分离培养检测 法、荧光反应检测法、 化学染色检测法、噬菌体检测法、生物测定检 测法、离 体培养检测法等，操作相对粗放；精确度低；耗时长

18、；灵敏度差；需要多种方法配 合使用。而电镜检测、实时PCR （RT -PCR等精度较高、速度快（RT -PCR可以在采集到样品之后的1个小时内得出可靠检测结果 的方法，一方面仪器设备昂贵，另 一方面对操作人员的技术水平要求也较高，如直接应用到实践中还存在一定困 难。科学的发展尤其 是免疫学和分子生物学日新月异的进步，将使用于检测种传 植物病原细菌的方法不断突 破旧的局限，使新的、适应不同需要的方法层 出不 穷。目前，我们正在用免疫磁性分离法 针对番茄细菌性斑点病种子带菌情况进行研 究，用全菌体抗原和膜蛋白抗原制备抗体，得到了效价分别为640和1280（试管凝 集法的抗血清，为后继工作打下了基础

19、。总的来 说新的分析 手段将向短时间、高 精度、自动化、微量化、尽量减少人为因素的方向发展，这无疑会给不同检测目 的的需要不断提供更合适的方法。然而任何一种方法都有其适用 范围，对于不同 目标的检测，得到灵敏度、可靠性和高效性的最优组合,制订标准化方案，仍是我 们面临的重要问题。参考文献1陈鹤生编1种子病害简明教程1农业出版社，1983 2Paul Neergaardt （狄原渤等泽1种子病理学1农业出版社,19873赵友福等1植物病原细 菌简明手 册1农业部植物检疫所编印，19924T ri galet A, Bi daud P 1Some aspects of epidemiology o

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