关于芪丹通脉片联合骨髓间充质干细胞移植对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡及心功能的影响

1、关于芪丹通脉片联合骨髓间充质干细胞移植对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡及心功能的影响作者：王文,王宗仁,张金洲,李军昌,苏海砾,王文勇,马福成,李静 【摘要】目的观察芪丹通脉片联合骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡、心功能的影响。方法采用密度梯度离心法体外分离培养大鼠MSCs,扩增至第3代后,应用溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记细胞。16只健康SD大鼠随机分为芪丹通脉片联合移植组与单纯移植组,分别灌服芪丹通脉片浸膏干粉溶液(2g/kg)和等体积生理盐水,每日1次,连续14d。结扎大鼠冠状动脉左前降支,制备急性心肌梗死模型,将BrdU标记的异体MSCs以微量注射的方法移植入

2、缺血心肌内。移植后3h应用HP5500超声诊断仪,探头频率12MHz,检测大鼠心功能,4周后复查,并用免疫荧光法检测缺血区的微血管密度(MVD),用脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的dUTP缺口末端标记法(TUNNEL)检测心肌细胞凋亡指数(AI)。结果芪丹通脉片联合移植组与单纯移植组大鼠心功能均有所改善,而芪丹通脉片联合移植组改善更明显(芪丹通脉片联合MSCs移植能改善急性心肌缺血大鼠的心功能,减少心肌细胞凋亡,增加缺血区MVD,与MSCs单纯移植组比较疗效更显著。 【关键词】芪丹通脉片；骨髓间充质干细胞；心功能；心肌细胞凋亡；大鼠 Abstract：ObjectiveToobserveth

3、eeffectofmarrowmesenchymalstemcells(MSCs)transplantationcombinedwithQidantongmaitabletandsimpleMSCstransplantationonmyocardialcellsapoptosisandheartfunctioninacutemyocardialischemiarats.MethodRatMSCswereisolatedbydensitygradientmethod,andthenculturedandamplifiedtothethirdpassagelabeledwithBrdU.16SDr

4、atsweredividedintotwogroupsrandomly,transplantationcombinedwithQidantongmaitabletgroupandsimpletransplantationgroup.TheisochoricofsuspensionofQidantongmaitablet(2g/kg)andNSwereadministeredtoSDratsbygastrogavagerespectivelyfor14days.Theleftanteriordescendingcoronaryarteryofratwasligatedtoestablishani

5、malmodelsofacutemyocardialinfarction.TheMSCslabeledwithBrdUwereimplantedintramyocardiallyintotheinfarctarea.After3hours,theheartfunctionweredetectedbyanechocardiographicsystem(HP5500system),equippedwitha12MHzprobe.After4weeks,theheartfunctionwererecheckedandMVDweredetectedbyimmunofluorescence,myocar

6、dialcellsapoptosisweredetectedbyTUNNEL.ResultsHeartfunctionwereimprovedinbothgroups,andwasmoresignificantinMSCstransplantationcombinedwithQidantongmaitabletgroup.ApoptoticindexweredecreasedandtheMVDofischemiczonewereincreasedintransplantationcombinedwithQidantongmaitabletgroupthansimpletransplantati

7、ongroup.ConclusionMSCstransplantationcombinedwithQidantongmaitabletcouldimproveheartfunctionofacutemyocardialischemiarats,decreaseapoptosisofmyocardialcells,increasetheMVDofischemiczone,thetherapeuticeffectweremoresignificantthansimpleMSCstransplantation. Keywords：Qidantongmaitablet；marrowmesenchyma

8、lstemcells；heartfunction；apoptosisofmyocardialcells；rat 前期研究表明,益气活血复方芪丹通脉片含药血清具有体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向内皮细胞分化的作用1。本实验旨在探讨芪丹通脉片协同MSCs移植可否增加局部微血管密度(MVD)及对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡、心功能的影响。 1实验材料 1.1动物 2月龄SD大鼠3只(制备MSCs用),雄性,体质量(10020)g；健康成年SD大鼠16只,雄性,体质量(25020)g,中国人民解放军第四军医大学动物中心提供。 1.2药物 芪丹通脉片浸膏干粉(黄芪30g,丹参30g,当归15g,桂

9、枝10g,红花30g,此制剂1g相当于原材药2.86g),西京医院药剂科提供。 1.3主要仪器与试剂 小动物呼吸机、二氧化碳孵箱(HERAcell),激光共聚焦显微镜,percoll分离液(pharmacia公司),F12-DMEM培养基、进口胎牛血清(JIBCO公司),BrdU(pharmacia公司),小鼠抗BrdU单克隆抗体,小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体,FITC标记的山羊抗小鼠二抗,HP5500超声诊断仪,TUNNEL试剂盒(武汉博士德生物技术公司)。 2实验方法 2.1分组 成年SD大鼠16只分为芪丹通脉片联合移植组与单纯移植组,造模前分别灌服等体积芪丹通脉片浸膏干粉溶剂(2g原药材

10、/kg)及生理盐水14d(医药学/临床医学论文 2.2骨髓间充质干细胞的分离、纯化和培养 将3只幼龄SD大鼠断颈处死,浸泡在75%乙醇中5min,取出后用无菌PBS冲洗鼠体至无乙醇,在超净台下无菌取下股骨、胫骨置于平皿中,更换器械及超净台,剔除周围肌肉组织等,用PBS反复冲洗。剪去骨干两头的关节面,暴露骨髓腔,用7号针头穿刺两骨端,用5mL含10%FBS的F12-DMEM冲出骨髓入离心管,1500/min离心10min。弃上清,用F12-DMEM重悬细胞,轻轻叠加到新鲜配制的密度为1.073的percoll分离液上,2500r/min离心30min,收集界面层混浊液,用PBS洗涤2次。然后用F

11、12-DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素)重悬细胞,按1106/mL的密度接种,37、5%饱和湿度的CO2孵箱培养,5d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,34d换液1次,接近融合的MSCs用含0.1mmol/LEDTA的0.25%胰酶室温消化,按13比例传代,传至第3代。MSCs回植前48,换用含5mol/L5-BrdU的F12-DMEM培养液培养。临用前加入0.25%胰蛋白酶消化,离心、收集细胞,调整细胞密度备用。 2.3造模 2组大鼠于第15日,采用Olivette方法,结扎冠状动脉建立急性心肌梗死模型。50mg/kg戊巴比妥腹腔麻醉,气管

12、插管,呼吸机正压辅助呼吸；开胸暴露心脏,以4-0无损伤线结扎左冠状动脉前降支,造成左室前壁心肌梗死模型。 2.4骨髓间充质干细胞移植 2组大鼠于左冠状动脉前降支结扎后1,直视下在梗死心肌周围用微量注射器分4点植入标记5-BrdU的MSCs(5106个细胞/100L),每点25L。关胸,维持辅助呼吸至自主呼吸恢复,送回笼中饲养。 2.5超声心动图 移植后3h及移植后4周,乙醚麻醉大鼠后固定,左侧胸部剃毛,经胸应用HP5500超声诊断仪,探头频率12MHz。取乳头肌水平左室短轴切面,分别于左室收缩末期(LVES)和左室舒张末期(LVED)在二维图像上测量左室舒张末期前后径(LVEDD)、左室收缩末

13、期前后径(LVESD)、收缩末期室壁厚度(WTS)、舒张末期室壁厚度(WTD)、前壁室壁增厚率(AWTF)、后壁室壁增厚率(PWTF)。所有数值均由连续3个心动周期测量数据平均得出。根据测值计算左室短轴缩短率(FS)及室壁增厚率(WTF)。FS(%)(LVEDDLVESD)/LVEDD100；WTF(%)(WTS-WTD)/WTD100。 2.6心肌细胞凋亡检测 于移植后4周股静脉注射10%KCl处死大鼠,使心脏停于舒张期,开胸取出心脏,PBS经主动脉灌注冲洗,立即行冰冻切片,丙酮固定,用脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的dUTP缺口末端标记法标记凋亡细胞核,具体操作同试剂盒说明,DAB显色。

14、每个切片于光镜下200倍放大,随机选取5个视野,检测阳性表达率(阳性核占总细胞核的百分比)作为细胞凋亡指数(apoptoticindex,AI)。免费论文下载中心 2.7缺血区微血管密度检测 冰冻切片PBS冲洗两遍,加入150抗CD31小鼠单抗,置于湿盒中4过夜,PBS洗涤后加150FITC标记的山羊抗小鼠IgG,37孵育50min,洗片后用伊文氏兰复染,50%缓冲甘油封片。于荧光显微镜下观察CD31阳性细胞,CD31阳性细胞胞浆呈绿色,毛细血管密度以每高倍镜视野(400)CD31阳性数表示,每张切片随机选取5个视野。 2.8统计学方法 所有数据采用xs表示,采用方差分析和t检验进行统计学处理

15、,P0.05有统计学意义。 3结果 3.1骨髓间充质干细胞变化 接种后的细胞24h可见较多圆形细胞悬浮在培养液中,48h可见贴壁细胞,较悬浮细胞体积大,大小较均一,核大多为圆形,位于细胞中央。89d后,部分细胞成梭形,个别成三角形。换液后57d基本融合铺满,至第3代,细胞呈长梭形集落样分布,形态较均一。 3.22组大鼠心功能改变 2组大鼠造模后心电图均出现T波高尖改变,联合组有1只大鼠死于造模后的室颤,其余大鼠均存活。2组大鼠在移植后3h检查M型心脏超声均显示：前壁运动幅基本消失。移植后4周联合移植组M型心脏超声显示：左室前后壁运动幅度正常,运动时相基本一致。单纯移植组4周后M型心脏超声显示：

16、前壁运动幅度基本正常,但其运动时相较正常后壁明显延迟。2组移植后3h和移植后4周心功能检测值比较见表1。表12组大鼠移植后3h及移植后4周心功能检测值比较(略)注：与移植后3h比较,P0.05；与单纯移植组比较,P0.05。3.32组大鼠移植后4周心肌细胞凋亡比较 TUNNEL染色结果显示凋亡细胞胞核呈棕黄色,联合移植组心肌缺血区心肌细胞AI为17.235.46,较MSCs单纯移植组AI(24.979.68)明显下降(P0.05)。 3.42组大鼠移植后4周心肌缺血区微血管密度检测 400倍视野下,联合移植组微血管密度即CD31阳性细胞24320.3,较单纯移植组19712.6明显增加(P0.

17、05)。 4讨论 近年来研究发现,通过冠脉或心肌局部注射将MSCs导入心肌缺血的微环境中,可以分化为血管内皮细胞(EC),促进局部血管新生,达到改善心肌缺血目的,从而成为心血管领域的研究热点。新生血管的形成可降低梗死灶周边肥大心肌细胞的凋亡,挽救有活力的心肌细胞,减少胶原沉着,改善心功能2。但由于MSCs在体内缺血微环境中的分化效率有限,因此,是否存在一种方法可以提高MSCs的分化效率,增加血管新生,提高疗效呢？本实验旨在观察和探讨应用芪丹通脉片联合MSCs移植可否促进MSCs向血管内皮细胞分化,从而提高局部MVD,改善心功能,降低心肌细胞凋亡。研究结果发现：经MSCs移植后4周,急性心肌梗死大鼠的心功能较移植后3h明显改善,而芪丹通脉片联合移植组心功能改善更为明显,且联合移植组心肌细胞凋亡指数较单纯移植组明显降低,MVD明显增加。表明芪丹通脉片具有协助MSCs移植治疗急性心肌梗死、提高局部微血管密度、改善心功能、减少心肌细胞凋亡的作用,可望为临床协助MSs移植增加疗效提供一种安全、有效的治疗手段。 【参考文献】1FukudaK.Developmentofregenerativecard